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(無題) 削除/引用 No.12185-11 - 2024/02/23 (金) 13:48:02 - おお キャピラリー型はプレランの工程はないのかしら。核酸とウレア由来シアン酸との反応は蛋白で色々指摘されているにもかかわらず、聞いたことがないですね。。。核酸につかうウレア入のバッファー等の商品が室温保存だったりして、核酸は大丈夫なんやと漠然と思ってましたが、、、 Ureaの入った状況でRNAをボイルして、Ureaの入った変性条件下のゲルで泳動して、更にそこから切り出して使うとかありますもんね。

(無題) 削除/引用 No.12185-10 - 2024/02/23 (金) 11:47:50 - toto 話がずれますが、この件で昔から不思議に思ってるのが、キャピラリー型のシークエンサーで使われるポリマーです。これも確か、尿素溶液のはず。使用期限が4度で数ヶ月とされてますが、実際には機械の中に入れて１−2週間は室温に置かれます。mMオーダー程度シアン酸とアンモニア、カーボネートができても全体の数％程度なので泳動自体には影響せず、また塩基との反応は無視できる程度、ということなのでしょうか。それとも、ポリマーにはureaでない、別のものが使われてるのか、あるいは何か安定化剤がはいってるのでしょうか？単なる好奇心ですが、どなたかご存じであれば教えてください。

(無題) 削除/引用 No.12185-9 - 2024/02/23 (金) 06:39:06 - おお DOI: 10.1016/0005-2795(71)90003-1 １Mで０度で一日数マイクロモルのシアン酸が発生していることになりますかねぇ。 DOI: 10.1016/0003-2697(64)90135-6 6.6Mで５度のときmM単位で３０日前後で立ち上がりが見られますね。常温だと１０日でも５mMほど発生している。 １gの数十kDaの蛋白で1 mg/ml なら１０マイクロMぐらいでしょうかね。 まあ蛋白に対しての反応性も考慮するべきですけど量的には嫌な感じですね。 （計算間違ってたらご指摘ください） ８Mは４度で溶けますでしょうか。凍結で確かにマシにはなりそうですが、数字がわかりませんし。析出していたら溶かす面倒もなくはない（作るより楽かもしれませんが）。 あと高濃度のUreaとかボトルに入れて立てておいても、どういうわけか蓋の周りにUreaが吹き出るように析出してきたりする。 それとTrisは攻撃されないのかしら？ また、蛋白へのcarbamylationを保護するのにヒスチジンなどのアミノ酸を入れておくと良いなんていう話もありました。 https://patents.google.com/patent/WO2005051979A1/en

(無題) 削除/引用 No.12185-8 - 2024/02/22 (木) 20:55:45 - バチラス 6M尿素+2Mチオ尿素溶液を含むサンプルバッファーをSDS-PAGEに用いています。常温で調整し、-80℃で小分けにして保存していますが、PAGE後のイムノブロットでは標的が単一バンドとして検出されており、カルバミル化でスメアーになるなどのトラブルは今のところありません。イオン交換レジンで溶液中のシアン酸を除去してから使うプロトコルもあるようですが、めんどくさいので尿素とチオ尿素だけは新品を買ってそのまま使用しています。

(無題) 削除/引用 No.12185-7 - 2024/02/22 (木) 20:08:41 - Bhじゅ 尿素は低温ではたいへん溶けにくく析出しますので、とかす時は室温ないし３７℃程度（ただしこれを超えるような高温は避けるべき）にしばらくおいて十分溶かしたのち、よく混和して均一にしてからお使いください。高温に晒したり溶液状態であまり長期間放置していると尿素が分解してタンパク質のシステイン残基を修飾するようなあまりよろしくない物質が生じてきます。なので一度溶解したものは再凍結はせず捨てたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.12185-6 - 2024/02/22 (木) 16:31:05 - tzm qqさん ありがとうございます。たしかにそのやり方なら、すぐに作れそうですね。 Bhじゅさん １回の必要量プラスαでチューブに分注して-80℃凍結するとありますが、-80℃で分注凍結すれば、解凍しても問題なく８M尿素溶液として使用できるということですか。

(無題) 削除/引用 No.12185-5 - 2024/02/22 (木) 14:14:38 - Bhじゅ 8M尿素はほぼ飽和に近いので、高濃度ストック溶液は作れません。なのでやり方は２つで、 用事調製する。（私たちはそうしてます） あるいは その組成の溶液を作成して、１回の必要量プラスαでチューブに分注して-80℃凍結する。 ということになると思われます。

(無題) 削除/引用 No.12185-4 - 2024/02/22 (木) 14:09:51 - qq あなたの作成方法は正統な気もしますが、もっと簡便な方法を選ぶ場合が多いのではないでしょうか。 私の場合、 １）1M Tris-HCl(ｐH8.5)を作成する。 ２）24gの尿素に、2.5mlの１M Tris-HCｌ（pH8.5）を加え、DWを23ml程度加え溶解する。 ３）必要であれば、pHを確認してHCl/NaOHで調整する。 ４）50mlに液量を揃えて、再度、全重量を測定できると嬉しいですね。 全重量が判ると、DW＋pH調製用の数滴の重量が判るので、全体積を測定しないという暴挙もありうるのです。

(無題) 削除/引用 No.12185-3 - 2024/02/22 (木) 13:05:28 - tzm qqさん 24gの尿素、300�rのtris baseを50mlのチューブに入れて、ミリQ水を足したあとに尿素が溶けるまで混合し、その後に１Ｎ　HCLを足して、Ph8.5に併せて、最後にミリQ水をもう少し足して、50mlにメスアップしました。

(無題) 削除/引用 No.12185-2 - 2024/02/22 (木) 12:32:31 - qq 組成だけだとどうやって作っているのか分からない。 あなたはどのようにして調製・整しているのでしょうか？

８M　尿素溶液の保存法 削除/引用 No.12185-1 - 2024/02/22 (木) 11:14:44 - tzm 簡単な質問ですみません。蛋白変性剤で８M　尿素を使用したいのですが、保存は常温だとシアン酸が発生することがあり、毎回調整が良いと本には書いてありますが、毎回調整するのは、結構手間ではあります。 みなさん、常温で保存の経験ありますか。または冷凍保存が良いとかありますか。 組成は 尿素　８M Tris　base 50mM HCI Ph8.5 ミリQ水 です。

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