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(無題) 削除/引用 No.12173-5 - 2024/02/17 (土) 04:24:18 - おお どんな前提なのかでアプローチは違ってくると思いますけど、ある程度察しがついているのであればその領域のPCRとかでも見れます。ノーザンでというのもわからなくないですが、例えば１００bほどInclude/excludeされるとするならばサイズで見分けることは難しい（１kb以上のmRNAが大多数を占めていますので）と思います。そうするとスペシフィックなプローブが必要ということですし、スペシフィックなプローブを用意できるということはPCRでもできるという理屈も成り立ちます。 違うアプローチとしては全長をクローニングして行くというやり方はありますが、すべてのアイソフォームが見つかるかどうか保証はありません。 見落としそうなのは例えばTSSが２箇所あって上流のTSSから始まったものは下流のTSSからのエクソンを飛ばしてスプライシングがされるような場合やAlternative exonsがそれぞれPolyA siteを持っていて下流に共通のエクソンがない場合です。１ペアーのプライマーセットでは見れないので。そういうところは３’または５’ Raceも必要かもしれません（あらかじめ予測ができているならPCRは可能ですが。 ゲノムからの予測に基づいてPCRで確認していくということもあり得るアプローチでしょう。大体の可能性があるスプライシングサイトは抽出できますので。人やマウスなどゲノムプロジェクトが進んでいるものでではそういうものをまとめてあります。酵母Drosophilaなど見てみましたが実際検出されているAlternative splicingも示されてなかったりするので生物種によっては弱いかも。ただ、網羅的にスプライシングを検出するのはされていて論文になっていますのでそこから抽出することは可能です。 https://useast.ensembl.org/Danio_rerio/Gene/Summary?db=core;g=ENSDARG00000091001;r=17:53438795-53440284 www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/12370 あとAceViewなんかでも見れるけどなんか繋がりにくいな、、、いま www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/index.html でも今の技術で一発解決しそうなのはやっぱりlong readのRNA-seqかな。

(無題) 削除/引用 No.12173-4 - 2024/02/16 (金) 23:18:16 - SYBR master >[Re:1] KKRさんは書きました : > splicing variants の解析したいです。ある細胞である遺伝子のmRNAの主なスプライシングバリアントの種類と大きさを調べたいのです。で、昔からノーザンブロっティングがあるわけですが、他に良い方法ありますか。 mammmalなら「RefSeq」とかでは駄目ですかね?最近(と言っても10年位経つかもしれないけど）、そっち界隈のデータ見てないんですが、ESTとかRNA-seqのデータをgenomeに貼り付けたデータベース有ったような気がするんですけど。それではデータ足りないですか？ Splicing variantsなら基本、真核のそれも多細胞生物(単細胞は殆どsplicingしない、たとえばyeastとか）なので、mouseやhumanならデータベースに近いもの有ると思いますけど。 実験的には、先に書いている二人の方法が的確だと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.12173-3 - 2024/02/16 (金) 23:01:07 - 独り言 逆転写PCRしてから、Total cDNAをそのバリアントの可変部分の外側からプライマーを設計してPCRすれば、長さの違うバリアントなた一挙にみれるでしょ。

(無題) 削除/引用 No.12173-2 - 2024/02/16 (金) 22:32:18 - G25 long readのRNA-seq

スプライシングバリアント調べる件 削除/引用 No.12173-1 - 2024/02/16 (金) 22:29:18 - KKR splicing variants の解析したいです。ある細胞である遺伝子のmRNAの主なスプライシングバリアントの種類と大きさを調べたいのです。で、昔からノーザンブロっティングがあるわけですが、他に良い方法ありますか。

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