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(無題) 削除/引用 No.12172-11 - 2024/02/19 (月) 09:41:37 - のなめ ジップロックで保管して、バッファーでもみもみをやってます。 -80℃で保管のばあい、冷凍庫から出してすぐに袋を開けたりの操作をすると、継ぎ目が裂けておもらしするので、それだけ気をつけてください。 10L分で作業時間は20-30分くらいです。

(無題) 削除/引用 No.12172-10 - 2024/02/17 (土) 04:49:49 - おお ポリトロンのようなものがあれば、凍結した菌体にバッファーを加えてポリトロンで破砕すると早いと思う。ポリとロンでなくてもペレットが緩んで外れそうになったときに小型ミキサーとかに１０本ぶんほりこんでミキサーで破砕するとか。小型ミキサーの器をあらかじめ冷やしておけば温度上昇は防げるし。 https://my-best.com/2171

(無題) 削除/引用 No.12172-9 - 2024/02/17 (土) 01:39:44 - 経験者 培養液1Lあたり50mLチューブx20本を10セット懸濁するのに１時間なら早い方・・？ 大型遠心機の遠沈なら500mL容器ｘ20本を冷凍できる環境があればできないこともないが ペレットから懸濁状態に持っていくのに 50mLチューブならボルテックスから目視で懸濁具合が確認できるけど 500mL分だと数分ピペッティングして納得できるかどうか 懸濁液量が多くなればなるほど底から離れているけど細かくちぎれたペレット塊が確認し辛くなるから・・ 破砕してしまえばその過程である程度塊は砕けていくけど破砕環境が変わるからどこまで許容するか 自分が大スケールやってた頃はタゲ自体が１種類をｇ単位で量取れれば良いっていうグレードだったから 朝一回収、懸濁、破砕して精製（時間ない日は破砕後上清までで冷蔵）のスケジュールで 500mL容遠沈ごとに専用のハンドミキサー突っ込んで懸濁、そのまま氷水に浮かしてソニケーターだったけど せん断や摩擦温度気にしたり種類が複数だと清浄な50mLピペットで丁寧にほぐす方がダメージないかも ハンドミキサーと言ったけど適当に料理用の電動撹拌機は今やたくさんあるから ミルクスチーマーみたいな100均モノや数千円レベルまで 底まで届きかつ遠沈容器を傷つけない速度で回転、洗いやすくできればオートクレーブもできる耐久 なんてものはあるかもしれない

(無題) 削除/引用 No.12172-8 - 2024/02/16 (金) 18:53:30 - Str 皆様 早速のコメント大変ありがとうございます。 予め破砕バッファーに懸濁してから凍結、やってみようと思います。 溶かすのは温浴でしょうか？ ターゲットのタンパク質はかなり分解されやすく、凍結ペレットに破砕バッファー(含プロテアーゼ阻害剤)を加えて4℃オーバーナイトで解凍してから懸濁、というのを以前やった事があるのですが、通常よりも分解産物が増えてしまいました。 実は、温浴でさっと溶かしてしまう方がダメージ少ないかも、と思いましたので比較してみようと思います。 大型化遠心機用のチューブでダイレクト処理も面白いアイデアです、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12172-7 - 2024/02/16 (金) 18:20:18 - あの 自分なら次の手抜きします: 大型遠心機用の遠心チューブを、多めに入手して、 その中で凍結保存から抽出までしてしまう。

(無題) 削除/引用 No.12172-6 - 2024/02/16 (金) 18:17:43 - G25 >大型遠心機を用いて集菌し、菌体ペレットをスパチュラで掬って、1L分を50mLチューブに移して凍結保存しています。 ペレットを掬うんじゃなくって、この時点でバッファーに懸濁してリキッドハンドリングで分注して凍結したほうがスマートじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.12172-5 - 2024/02/16 (金) 18:12:52 - G25 ペレットを凍結保存したから再懸濁しにくくなるってもんでもなくて、沈殿後即、再懸濁しようとしてもたいして変わらないであろう、かなりの労力だと思います。 1 L培養液分のペレットを50-mLチューブだとかなり窮屈じゃないですか。十分な量の懸濁バッファーを入れられないので、余計、再懸濁が困難になっているのかも。 ステンレスなんかの破砕用ビーズをいれてガシャガシャ振るのはどうですか。 本来、振盪破砕装置でもって細胞や組織片の破砕なんかに使うものですが、 細菌ペレットの再懸濁くらいなら、手で振ってもいけそうな気がする。 https://taitec.net/product/%E3%82%B9%E3%83%86%E3%83%B3%E3%83%AC%E3%82%B9%E3%83%93%E3%83%BC%E3%82%BA2mm70g/

(無題) 削除/引用 No.12172-3 - 2024/02/16 (金) 17:51:27 - 774R ペレットのまま凍らせると、解凍した時に菌体が破裂してゲノムDNAで粘性が上がるので懸濁がますます困難になるんですよね。 おおさんの言われるように、私はバッファーに懸濁してから凍結してます。 破砕方法にもよりますが、プローブ式のソニケーターで行うのであれば、懸濁が不十分なままソニケーションすれば懸濁と破砕を同時に行えるので時短になります。

(無題) 削除/引用 No.12172-2 - 2024/02/16 (金) 17:39:59 - おお 回収したらすぐにバッファー加えてボルテックスしてから凍結保存すれば？ あるいは凍結から戻すときに、バッファー入れてチューブを氷水につけておく。氷より溶けるのが早いはず。 大腸菌を回収する時にグラスビーズを入れておくと、戻すときにある程度緩くなってきたらボルテックスで凍ったぶぶんを破砕できる。

大量の菌体ペレットを迅速に懸濁する方法 削除/引用 No.12172-1 - 2024/02/16 (金) 17:16:54 - Str 表題の件につきまして、皆様のお知恵をお借りできればと思います。 構造研究のために、1L×10本のラージスケールで培養した大腸菌から組替えタンパクの精製を行っています。 大型遠心機を用いて集菌し、菌体ペレットをスパチュラで掬って、1L分を50mLチューブに移して凍結保存しています。 精製日に破砕バッファーを添加し、電動ピペッターで突いて崩しながら懸濁しているのですが、合計で1時間以上掛かってしまいます。 保管方法を変えたら、迅速にバッファーに懸濁できないかなぁと考えています(例えばジップロックで凍結しておき、バッファーを入れたら揉み込む等)。 何かアイデアをいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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