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(無題) 削除/引用 No.12171-8 - 2024/02/19 (月) 10:19:41 - 泣きそうな大学院生 皆様 ご回答ありがとうございます。 皆様がおっしゃる通り、リン酸化が見れている先輩と隣で並んで実験したこと自体はあり、その時は自分でもリン酸化タンパクのバンドを確認できました。 その後、同じ抗体、同じサンプルを用いて、同じ手順で実験を行ったつもりだったのですがバンドが見えなくなってしまい原因が分からず悩んでいる状況で、何かしら手順の問題が分かればと思い質問させていただいた次第です。 同じリン酸化抗体を使っている後輩がいるので、次は後輩にお願いして一緒にウエスタンを流してもらおうと思います。

(無題) 削除/引用 No.12171-7 - 2024/02/18 (日) 10:06:57 - い 追記します。 同じメーカーの同じ抗体が２つあって、１つは新しくて、もう一つは古くて、（つまり型番は同じですがロットが違う）前者を使った人はうまく検出できて、後者を使った人はうまく検出できないということで混乱したことがありました。一応その辺も確認ください。 すでに指摘のあります、phosphatase inhibitorについても重要と思います。ただinhibitorしっかり入れてても脱リン酸化してしまうこともあるし、入れなくても全然脱リン酸化されないこともありますので、対象となる蛋白質によりケースバイケースです。サンプル調製してから電気泳動するまでの保存状態（-20℃、ー80℃ or 調製後はその日のうちにすぐ泳動）や保存期間もしくは泳動するまでの時間も結構重要なファクターになり得る様な気がしています。その辺りの（一見瑣末なことのように思える）ことも、周りで検出できている人にどのようしているか聞いてみましょう。

(無題) 削除/引用 No.12171-6 - 2024/02/17 (土) 09:15:12 - .. Phosphatase inhibitorはちゃんと効いてるかな？ 試薬は説明書とかちゃんと読んで扱えてる? 普通に見えるリン酸化なら阻害薬入れなくて出ないってことは覚えがないし、 試薬とか操作で何かエラーがでてそう。

(無題) 削除/引用 No.12171-5 - 2024/02/17 (土) 04:40:17 - おお PBSTよりTBSTのほうがいいとか、ミルクをブロッキングに使わないほうがいいとか多少リン酸化抗体でのコツみたいなのは存在しますが、同様にやってうまくいかないとなるとそこではなさそうな気もします。 同じサンプルと言っても保存状態がどうなのかもあるし、実はその実験では見えないのが本当の結果だったという落ちもあるかもしれない。 検出感度のレンジも幅広いので他の抗体で検出ができているからと言って、ほんとにうまく行ったときの１０分の１でも検出されてしまうことはかなりあるので、見逃していることがあるかもしれない。またWBは非常に段階が多く、多数のチェックポイントがあるのだからそれを上げていたら非常に長くなるし、そのうちのどれかというのはそうかも知れないけど、殆どはあなたと関係がないポイントと言える。 なので実際やった人がいるラボにいるのだから、そういう人と話をしながら、実際にやっているのを観てもらうとか、観せてもらうとかするのが近みちだとおもう。 そのうえで違っていたところが悪かったのかどうかなど答え合わせ、原理的なことの追求などでここで質問されるといいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.12171-4 - 2024/02/17 (土) 01:48:51 - ね 2レスの1行で終わってるけど 同じラボで再現できてる以上 プロトコルに書いてある以外のとこでミスがある 同じ試薬名でも違う場所に置いてある別Lotとか 撮影とだけ書いてあっても機器のモードや露光時間が違うとか

(無題) 削除/引用 No.12171-3 - 2024/02/16 (金) 17:38:29 - い 学生さんで何度かそういうケース見たことあります。一番多いのが、試薬のとり違え（2次抗体をrabbitとmouse間違えてたとか）です。容器の外見が非常によく似てて、置いてある場所も同じとことかだと起こりやすいです。慣れてくるとつい思い込みで、（冷静に確認すれば容易にわかることでも）そうした失敗をすることがあります。先入観を捨てて使用する試薬を一度全部再確認してみましょう（抗体の動物種など特に）。 ケースとしては少ないですが、周りが間違えてて、あなたの結果が実は正しいということも実際あります。

(無題) 削除/引用 No.12171-2 - 2024/02/16 (金) 17:18:06 - み となりで一緒に実験してもらえば解決する案件

ウエスタンブロッティングのリン酸化が見れない 削除/引用 No.12171-1 - 2024/02/16 (金) 16:34:02 - 泣きそうな大学院生 研究室で自分だけリン酸化抗体のバンドが検出できません。 同じ抗体、同じサンプルを使って研究室の先輩や後輩にウエスタンをやってもらったときにはリン酸化の強弱などはっきり見えるのですが、自分は何度やってもバンドが見えずメンブレンが真っ白で何も見えなくてとても困っています。リン酸化抗体いがいのタンパクはすべて検出できています。 プロトコールを他の人と比較しても同じで違う要素が分からなくてどうしようもない状況です。どこかしらの手技の問題か操作が足りていないかだとは思うのですが、リン酸化タンパクを検出する際に気を付けるべき操作などございましたら教えてほしいです。

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