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(無題) 削除/引用 No.12143-9 - 2024/02/09 (金) 15:25:32 - asan ＞実は、GSTが何か細胞に悪影響を与えているだけなのではなかろうかという疑惑が自分の中で浮上してきています。 そう思うならGSTなんてどでかいものがついてないものを購入して同様の応答がでてるかどうか調べればいいと思います。 ＞いくつもの論文で報告されている市販のGST融合リガンドタンパク質を使って細胞を刺激して様々な実験を行っています。 一般論として大腸菌でリコンビナントタンパク質を作る時にGSTを使うのは水溶性を向上させるためだったり、精製が容易だからってのがあります。まあ、大抵の場合は精製後のタンパク質そのものの機能性を評価するならばproteaseで最終段階でカットできる様にすると思いますが、GST-pulldownなどのin vitroでの実験も良くあります。 過去文献にて同等の実験を同様の方法で行われてるならそれで効果が出てればリビジョンで突っ込まれたりはしないでしょう。自分のみてる現象に対して特にうまく行ってないか非特異的作用を疑うならリコンビナントを用いてる時点でできるだけ生理的なものでも同じ効果がでることを別途確認するのがいいのでは？ それでも生じるのであれば、そもそも論としてその効果がKOした既知レセプターに依存しないメカニズムによって生じてる可能性があるというだけの話だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12143-8 - 2024/02/08 (木) 13:54:25 - あ さっさとGSTだけの反応を見ましょう。

(無題) 削除/引用 No.12143-7 - 2024/02/08 (木) 13:51:41 - ken これが、GSTの影響を見ているのが真であるならば、ここまでの努力が水の泡になるかもしれないので、絶望的な気分に今陥っています。

(無題) 削除/引用 No.12143-6 - 2024/02/08 (木) 08:29:07 - おお 精製リコンビナントだけでなく、過剰発現させた細胞のConditioned mediaなんかも使いようだと思います。コントロールとしてGSTを分泌させてもいいし、からベクターで別に蛋白が発現してない状態でもまあそれなりに使えるコントロールだと思います。

(無題) 削除/引用 No.12143-5 - 2024/02/08 (木) 08:16:01 - おお 商品だけを見ているっていうのがよくわからんところだけど、自前でGST融合リガンド、サイトカインやグロースファクターを調製して、どうじにGSTだけ（あるいはGSTに不活性型変異体を融合したもの）も精製し比べるといった論文はちらほら見かけます。まあ結論から言うとGSTを用意するのがベターだったと言えるでしょう。 でもだからといって完璧かというと、同じように精製されたリコンビナントを使っても精製時にCarry overしてくる分子の種類や量が両者で一緒かというとそれを証明する術はほとんどないので（LPSは測れるだろうけどそれでも濃度を揃えるのはまず無理）完璧な実験系というわけではないです。 なのでみなさんが指摘しているように、タグ無しリコンビナント、違うタグのものなども試したほうがいいでしょう。変異体作成もありです。考えているリセプターを（できれば発現の低い）細胞に過剰発現させて、シグナルの増強が見れるかというのもやってみてもいいかもしれません。 まあポジティブに捉えると、リセプターになりうるものが複数ある可能性もあるわけだから面白いことだと思います。細胞にふりかけてから細胞表面をクロスリンクさせて、そのリガンドに結合している分子が複数あるかどうか。KOした細胞で細胞表面へのアフィニティーを調べてみるとか、いろいろな細胞株で反応がある細胞、ない細胞を探してみるとか多角的な攻め方もできるでしょうから、お示しの結果は私なら（先走ってはいるかも知れないけど）ちょっとわくわくしちゃいます。

(無題) 削除/引用 No.12143-4 - 2024/02/07 (水) 16:07:40 - あ タグは常にその可能性が付きまとうので、別のタグにするとかタグだけの評価をするとか、可能であればタグ無しでもそうなるか確認はいるでしょう。 厳密にいえば不純物だって違うわけだし、実験のコントロールを取るしかないと思います。

(無題) 削除/引用 No.12143-3 - 2024/02/07 (水) 13:29:13 - 774R GST自体が細胞に刺激を与える可能性は、GSTのみで行ってみないことには結論は出ないですね。 GST以外にも、大腸菌由来の交雑物が影響してる可能性にも注意が必要です。その面でも、同じように精製したGST単体というのがコントロールとしてふさわしいでしょう。 場合によってはGSTとリガンドをプロテアーゼで切り離して使用するか、His-tagなど短いタグでも同様の効果が出るかなど、多面的に検証することをお勧めします。 GSTは二量体をとるので、見かけ上のAffinityが強く出る可能性がありますね。

(無題) 削除/引用 No.12143-2 - 2024/02/07 (水) 12:55:36 - TS とりあえずGSTでやってみるしかないのではないですか。 私の場合、GST融合タンパクは大腸菌で作る実験ばかりで市販品を使ったことはないですが、コントロールにGSTを使いますね。 GST単体で販売されているかも知らないですが、GSTのみなら封入体に入るとかいうこともなくすぐに作れるでしょうから、検討してはどうでしょう。 それが効かなければ、他の受容体があるという路線で。

GST融合リガンドタンパク質って一般的ですか 削除/引用 No.12143-1 - 2024/02/07 (水) 11:40:21 - ken Ligandとreceptorの下流を研究しています。 いくつもの論文で報告されている市販のGST融合リガンドタンパク質を使って細胞を刺激して様々な実験を行っています。 RNA-seqを行うとPBSとリガンドでは明らかな差がでますが、つい最近、そのリガンドの受容体を欠損させてもこの差は何も変わらないことがわかりました。 別のリガンドが存在してその経路が重要ということであればそれでいいのですが、最悪のケースとして、実は、GSTが何か細胞に悪影響を与えているだけなのではなかろうかという疑惑が自分の中で浮上してきています。 論文を信用しきっていたため、これまでこのリガンドを使い続けてきたのですが、GSTが細胞に何か悪影響を与えて表現型を与える可能性はありますでしょうか。細胞は癌細胞を使用しています。 他の論文ではPBSがコントロールになっているため、GSTをコントロールとしなかったのですが、今となるとそれが悔やまれます（GSTのコントロールはそこまでメジャーな商品でもないようです）。 何かご助言いただけないでしょうか。

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