BioTechnicalフォーラム [サンガーシーケンスでヘテロか微妙な時の判断]

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(無題)

No.12139-15 - 2024/02/07 (水) 23:10:43 - りすざる

SYBP masterさん、ありがとうございます。

返信が遅れてしまっており申し訳ないです。

わざわざデータを見直してくださったとのこと、本当にありがとうございます。
確かに対象の420bpのところでも、二つのピークを足した高さが周りと同じくらいになっておりました。
ホモ接合である可能性は限りなく低そうですね。ヘテロ接合かモザイクという線で今後は考えていきます。

また、ソフトが古いと下流ではSNPの存在比率を反映できていないというご指摘、誠にありがとうございます。Raw Dataさえあれば、最新のbasecallerを用いることで結果が改善される可能性があるということですね。私の研究室に使用可能な他のbasecallerがないか探してみます。

>sequenceだけで評価するなら、この部分がシークエンスしたときに150-180 base位にデータが出るようにするともう少しキレイなデータが出るかもしれません。新たにPCRで増やさなくても、primerをこのSNPの220-230 base前に設定できれば、データは回収できます。これならかなり安く出来ますね。

非常に有益なアドバイスをありがとうございます！その発想は持ち合わせておりませんでした。
そうすればお金だけでなく、時間や手間がかなり省けますね。
元のDNAもかなり少なくなってきており、どうにかして節約しなければいけない状況だったので、非常に助かります。

今後はとりあえず、これらのサンプル以外の綺麗に読めたサンプルを解析にかけてみて、表現型とSNPの関連が見られたら、上記の方法でこれらのサンプルもデータを取り、解析に追加しようと思います(統計的に適切かは分かりませんが)。

(無題)

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No.12139-14 - 2024/02/07 (水) 20:22:10 - りすざる

SYBP masterさん、ありがとうございます。

https://www.sejda.com/share/3958de5d24c24aad8c92703da07a8402-yJ0CLHUubetqXltFZkxBtfGumYyiYBVl6TdKMn6RSD3OrV54ns5NwYTWlbuuXOBz
　↑
最初から最後まで、ピークが比較的安定していたクロマトグラムがありましたので、そのデータを先頭に追加しました。
追加したデータを見ていただきたいのですが、Phred scoreはヘテロの箇所とその周り数塩基では、上流下流関わらず、ゼロに近づくようです。ですので、Phred scoreが低いから完全に信頼できないとまでは言えないような気もしております。

>一方で、2枚目の方は鋳型量が適切なため、クロマトのピークの高さが後半でもそこそこ取れています。ただ下流の部分で周りにGが少なく、かつ1塩基前がAな為、Basecallerは蛍光の被り(漏れ）と認識して少し低めに書き出している可能性はあります

そのような可能性もあるのですね。周りにGがない分Gの蛍光ははっきり(?)検出され、Aは連続しているため一つ前のAの蛍光の残り(?)と判断されたという理解で合っていますしょうか？
私の勉強不足で申し訳ないのですが、Raw Dataからクロマトグラムに書き出される際、そのような作為的な解釈は行われるものでしょうか？

私の勉強不足、経験不足を非常に優しく丁寧にフォローしてくださり本当にありがとうございます。
どうぞよろしくお願いいたします。

(無題)

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No.12139-13 - 2024/02/07 (水) 20:05:19 - SYBR master

時間が出来たので、特に2枚目の方がデータがキレイなので、もう少しクロマトデータを詳しく見てみました。

Aの後のGは比較的低くクロマトピークが排出されます(例えば、310, 330, 380, 400,410, 420 bp近辺)が、他は後ろのGにAのピークは出ていないので多分上手く分離できていますが、一方で、対象の420bpでは1個まえのAのピークと同じ高さでGのピークが出ていることから、多分SNPであることは間違いないです。SNPが有る場合、その二つのピークの高さを足した高さが、周りとほぼ同じくらいに為る場合(たとえば、160 bpのSNP)、SNPの可能性は非常に高くなります。しかし、ピークの高さは、多分ですが旧ABIのbasecallerでは400 bp位の所では、その存在比率とは一致しないと思います。

BasecallerはABI以外からも、長い所でもフレッドスコアーが高くなるようなもっとよさげなものが買えるんですけど、確か結構なお値段でした。

またABIからもSNP検出用のソフトも出ているんですが、
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/sequencing/sanger-sequencing/sanger-dna-sequencing/sanger-sequencing-data-analysis.html
たぶん日本円で100万以上(他のソフトを買おうとしたときそれくらいしたので)するかもしれません。

>私の現在所属している研究室には、クローニングのための設備や試薬が何一つ揃っておらず、クローニングは厳しそうです。

となると、sequenceだけで評価するなら、この部分がシークエンスしたときに150-180 base位にデータが出るようにするともう少しキレイなデータが出るかもしれません。新たにPCRで増やさなくても、primerをこのSNPの220-230 base前に設定できれば、データは回収できます。これならかなり安く出来ますね。

(無題)

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No.12139-12 - 2024/02/07 (水) 19:43:35 - りすざる

おおさん、ありがとうございます。

おっしゃる通り、このクロマトグラムだけで判断するのは限界があるのかもしれないです。
私の現在所属している研究室には、クローニングのための設備や試薬が何一つ揃っておらず、クローニングは厳しそうです。
A/A,A/G,G/Gそれぞれの個体で表現型が異なるか、ということを現在見ており、モザイク変異まで考慮すると解析が難しくなりそうなので、現状を考えるとこれらの個体は解析から外してしまうのが良いのかもしれません。

>もう一つやれることは逆から読むということですが、ではどちらが本当かという話になるとやはり結論を出しにくいと思います。
逆から読んでみても同じように、4:1ほどのピークの被りが見られました。

>がん組織から取っているならaneuploidyも気になります。
見ているのは哺乳類の口内細胞です。

>ヘテロでそれぞれの波形の高さが違う例を以下に上げておきます。
私のためにここまでしていただき、本当にありがとうございます。
示していただいたくらいの2:1ほどの波形の重なりですと、私もヘテロだと判断しているのですが、実際に見られるのが以下のfigure(2つ目と3つ目ではMatherのクロマトグラム)に見られるような波形で判断に苦心しております。
doi: 10.3389/fped.2019.00203
doi.org/10.1002/eji.201747445
doi.org/10.1002/mgg3.2161

上流のSNPの波形の高さが同じなら、下流のSNP波形の高さも同じようになるというのは、シーケンスのメカニズムを考えると、大変浅はかな思考でした。
非常に丁寧に教えてくださり、本当にありがとうございます。

(無題)

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No.12139-11 - 2024/02/07 (水) 19:11:06 - 774R

私も波形の高さが存在比をリニアに表わすとは思えないに1票。
存在比を調べるにはクローニング→シーケンスだと思う。

(無題)

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No.12139-10 - 2024/02/07 (水) 18:47:43 - ぽー

PCR産物をcloningして10～20コロニーぐらい読んでみてはどうでしょうか？
ヘテロでも1:1になることは少ないですが、4:1の場合と区別はできると思います。

(無題)

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No.12139-9 - 2024/02/07 (水) 10:35:42 - SYBR master

>[Re:5] りすざるさんは書きました :
> https://www.sejda.com/share/2b69d54b5bfe42fba87e1ce6d9880f20-o5jdSr-P7YlIqavg0ESTH4YvRyAr1SU2vFDlQ6mYwYaxSbM5U1Vdtr43VuWpc_eB

クロマトのデータを見ましたが、ぱっと見で思いついたのは1枚目はtemplateが多すぎて、既に400 base近辺でクロマトピークが低すぎです。これで比較するのは結構難しいです。4色蛍光のRaw data(それぞれ結構被りがある)からBasecallerで配列を書き出すのですが、templateが多すぎで配列初期のシグナルが高く、そこからシグナルが急激に低くなると、後半ではRaw dataではほぼ区別が付いていないので、ほぼ同じ高さになっているのかもしれません。Raw dataのピークが低くても、Basecallerは何らかのデータを吐き出します。塩基のデータの上にある棒状の物は、Phred score(フレッドスコア)で、その部分の配列のデータの品質を数字を示しています。Phred scoreに付いてはネット上に解説がありますのでそちらを参考にしてください。そのフレッドスコアを見ると、ほぼゼロに近いので、この部分での比較は妥当では無いことになります

> 2枚目の下流の方にある矢印の箇所が、解釈に苦しんでいる波形です。

一方で、2枚目の方は鋳型量が適切なため、クロマトのピークの高さが後半でもそこそこ取れています。ただ下流の部分で周りにGが少なく、かつ1塩基前がAな為、Basecallerは蛍光の被り(漏れ）と認識して少し低めに書き出している可能性はあります(そのため1枚目のフレッドスコアより高い数値になっています)。ただその場合、逆鎖を読んだときは普通に書き出されるはずなのですが、断定は出来ませんが後ろの塩基の蛍光の漏れと認識したのかもしれません。

(無題)

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No.12139-8 - 2024/02/07 (水) 03:54:12 - おお

>ホモ接合でもヘテロ接合でもなく、モザイク変異であると解釈していいか悩んでおります。

それは悩んでも結論が出ないと思います。確かにバックグランドのようなピークがでて、それが実際の配列を反映しているのかということもそれなりにあると思いますので、まずやることはその問題と思われる部分３００bpぐらいでいいからPCRしてプラスミドに挿入して１０クローンほど読んで見ればいいかと思います（ほんとにモザイク変異とかで比率が必要なときは少し多くないとわからないけど）。昔は論文に一言そうやって確認したと書いているフレーズをよく見たような気がしますが、sequencing chromatogramだけで判断するとか今は普通にやられているんでしょうかね。

もう一つやれることは逆から読むということですが、ではどちらが本当かという話になるとやはり結論を出しにくいと思います。

がん組織から取っているならaneuploidyも気になります。

また、ヘテロだからといって波長のピークの高さが一緒になるわけでもないのでchromatogramではあるかないかの判断といえなくもない(もちろん理想的なコンディションではうまく比率を反映しているデーターもあるにはある)。ヘテロでそれぞれの波形の高さが違う例を以下に上げておきます。

doi.org/10.3390/genes14020430
doi.org/10.2147/IJGM.S286421
doi: 10.12998/wjcc.v11.i25.5982

たしかAGのあとは場合によっては読みにくくなることがあるというのもあったと思う（リピートするとさらに）。大抵の場合大丈夫なんだけど。お示しのchromatogramでもAGと続いたときのGはピークが低い。そうなるとノイズがそこで若干あると、ノイズとGピークの差が縮まってしまう。

(無題)

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No.12139-7 - 2024/02/07 (水) 00:31:13 - りすざる

Raw Dataについて、ものすごい勘違いをしておりました。恥ずかしい限りです。
Raw Dataは見ることはできます。

(無題)

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No.12139-6 - 2024/02/07 (水) 00:12:46 - りすざる

> 一般的な解析ソフトなら、そこは「R」で表示されるはずなので、目視で見逃すことは無いと思います。ABIが提供していたソフトでも確か「R」表示だった気がします。データが解析できなくて、パニックな状況は解りますが、誇張されると話がややこしくなります。

設定の問題なのかも知れませんが、私が使用しているFinch TVでは、RとならずにA,G,Nのいずれかで表示されております。Rと表示されるソフトが一般的であることも存じ上げてはいたのですが、現実に即した記載をしました。分かりづらくしてしまい申し訳ございません。

> >しかし、いくつかの個体のDNAでは、Aのピークに、その4分の１ほどの高さのGのピークが重なっている波形データ(面積比4:1)が得られました。
> >そこでPCRからやり直すと、一部の個体では、Gの波形が消えてA/Aのホモ接合を示したり、2つのピークが重なるA/Gのヘテロ接合を示すといった綺麗な結果が得られたのですが、
>
> これは、問題となっている領域ですか？
>
> >残りの個体では4回ほどPCRからやり直してシークエンスを行っても、4回ともAとGの面積比が4:1ほどの波形データが繰り返し得られました。これは逆方向から読んだ場合も全く同じ結果になっていました(TとCが4:1)。
>
> これ読むと、上記の部分と違う所は比率が違うかのようにも、読めてしまします。私の読解力が悪いかもしれないので、場所を特定しながら書いて頂ければ有り難いです。

字数制限に気を使ったばかりに大変分かりづらい文章になってしまいました。
また、前半部分は完全に蛇足でした。重ね重ね申し訳ございません。
ここで述べていたのは、全て同じ箇所のことです。
いくつかの個体では、最初のシーケンシングではAとGの波形の重なりが微妙だったため、ヘテロかどうかの判断がつきませんでした。そのため、もう一度PCRからやり直したのですが、一部の個体のでは波形が綺麗に重なったためヘテロ接合、または片方の波形が消えたためホモ接合、というように解釈しやすい結果が得られたので問題はありませんでした。(このことについては書く必要がなく完全に余計でした。)
しかし、2回目、3回目とやり直してみても相変わらず波形が4:1ほどの重なりを示し続ける個体がおり、これらの個体の結果の解釈に苦しんでいるということを説明したかったのです。(全くうまく説明できておりませんでしたが。)

うまく説明できておりますでしょうか。
どうぞよろしくお願いいたします。

(無題)

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No.12139-5 - 2024/02/06 (火) 23:44:46 - りすざる

SYBR masterさん、ありがとうございます。
もっと推敲すべきであったと猛省しております。
ご不便をおかけしました。

> 1. クロマトのデータはThrmoの旧アプライドバイオ(いわゆるABI)のデータでしょうか？

そうです。

> 2. またその場合、当該SNPの周りのクロマトのピークは安定して、同じような高さですか？

全てが同じ高さとまでは言わないですが、突出して高いものや低いものはありません。
ノイズもなく、きれいな波形データが得られていると思います。

> 3.クロマトのデータは、解析ソフトで見ていますか?それともABIの機器に付いてくる基本ソフトで見てますか?

ソフトはFinch TVを用いております。

> 4. Raw data(生データ)は見れますか？

https://www.sejda.com/share/2b69d54b5bfe42fba87e1ce6d9880f20-o5jdSr-P7YlIqavg0ESTH4YvRyAr1SU2vFDlQ6mYwYaxSbM5U1Vdtr43VuWpc_eB

アップロードしました。
1枚目が、どちらもヘテロ接合だと解釈したSNPです。
2枚目の下流の方にある矢印の箇所が、解釈に苦しんでいる波形です。
ホモ接合でもヘテロ接合でもなく、モザイク変異であると解釈していいか悩んでおります。

(無題)

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No.12139-4 - 2024/02/06 (火) 21:49:41 - SYBR master

>[Re:1] りすざるさんは書きました :
> 得られた波形データにおいて、二つの塩基(AとG)のピークが重なっているところがあり(個体によっては目視で見逃してしまうくらいピッタリ重なっている）、これをA/Gのヘテロ接合と判定しています。

一般的な解析ソフトなら、そこは「R」で表示されるはずなので、目視で見逃すことは無いと思います。ABIが提供していたソフトでも確か「R」表示だった気がします。データが解析できなくて、パニックな状況は解りますが、誇張されると話がややこしくなります。

>しかし、いくつかの個体のDNAでは、Aのピークに、その4分の１ほどの高さのGのピークが重なっている波形データ(面積比4:1)が得られました。

これ見たときは、解析ソフトのBase call error(BCE)と思いました。ただ、

>そこでPCRからやり直すと、一部の個体では、Gの波形が消えてA/Aのホモ接合を示したり、2つのピークが重なるA/Gのヘテロ接合を示すといった綺麗な結果が得られたのですが、

これは、問題となっている領域ですか？

>残りの個体では4回ほどPCRからやり直してシークエンスを行っても、4回ともAとGの面積比が4:1ほどの波形データが繰り返し得られました。これは逆方向から読んだ場合も全く同じ結果になっていました(TとCが4:1)。

これ読むと、上記の部分と違う所は比率が違うかのようにも、読めてしまします。私の読解力が悪いかもしれないので、場所を特定しながら書いて頂ければ有り難いです。

(無題)

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No.12139-3 - 2024/02/06 (火) 21:37:58 - SYBR master

えーっと、まず落ち着きましょうかね。文章がとっちらかて解りにくいです。

クロマト(解析結果のデータ)のデータを見たわけでは無いので、あくまで推測でしか無いのですが、

1. クロマトのデータはThrmoの旧アプライドバイオ(いわゆるABI)のデータでしょうか？

2. またその場合、当該SNPの周りのクロマトのピークは安定して、同じような高さですか？

3.クロマトのデータは、解析ソフトで見ていますか?それともABIの機器に付いてくる基本ソフトで見てますか?

4. Raw data(生データ)は見れますか？

この情報があるだけで、少しだけですが推測しやすく成るかもしれませんが、ただあまり期待しないでくださいね、SNP関連はあまりやったこと無いので。

Raw dataとクロマトの関連も、最近導入を検討している機器のテストから使い勝手を任されて、20年ぶりくらいに「あれどうだったっけ？」と、思いながらデータ見ているんで。

サンガーシーケンスでヘテロか微妙な時の判断

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No.12139-2 - 2024/02/06 (火) 13:19:18 - りすざる

さらに調べたところ、自分と同じことで苦心されていた方の過去の質問を発見しました。(大変読みやすく、ほぼ同じ悩みですので、私の文章が読みにくい方はそちらを参考にしていただけますと幸いです)
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1279
この回答にありますように、成長過程で起きた体細胞変異によってモザイク変異となっている可能性というのは考えてはいたのですが、このような波形が見られたのは目的のSNPがある箇所だけで、他の箇所では一切そんな波形は見られなかったため、「そんな都合よくSNPがあると分かっている箇所のみでモザイク変異が発生するのか？」と疑心暗鬼でした。しかし、モザイク変異について調べるにつれ、生殖細胞由来ではないA→Gの体細胞変異がSNP箇所で起きた可能性が高そうと考えるようになりました。つまり、生得的にA/Gヘテロ接合を持つ個体とは別に、本来はA/Aのホモ接合を持っていた個体に遺伝子変異が起こり、1:1ではないものの4:1ほどの割合でGアレルの存在するモザイク変異を持つようになったという考えです。
前置きが大変長くなり恐縮ですが、上記のことを踏まえ皆様にお伺いしたいことが2点ございます。

1. 一方のピークにその4分の1ほどの高さのピークが重なっている、という波形データの解釈をしたことがある方がおられましたら、どのような解釈をしたのか教えていただきたいです。今回のようにモザイク変異であると解釈することは妥当なのでしょうか。

2.　集団で維持されているSNPが存在する箇所の方が、そうでない箇所より、体細胞変異による塩基置換が起こりやすい、というようなことはあるのでしょうか。(生殖細胞由来の)SNPが見られるということは、そこが化学的に遺伝子変異が起こりやすい配列であるとも考えられるので、体細胞変異も同様に起こりやすいと考えられそうなものなのですが、それについての記載がある文献を見つけることができませんでした。もし、経験的に何か知っている方がおられましたら教えていただきたいです。

大変読みにくい文章を長々と失礼しました。
駄文であることは承知しておりますが、どうかご回答いただけますと幸いです。
どうぞよろしくお願いいたします。

サンガーシーケンスでヘテロか微妙な時の判断

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No.12139-1 - 2024/02/06 (火) 13:17:47 - りすざる

初めまして。
うまくまとめられず、長い文章になってしまいましたので2つに分割させていただきます。
ある哺乳類の口内細胞から抽出したDNAを用いて、とある遺伝子のSNPの探索を行っています。100 個体以上からDNAを得られていて、各個体における目的遺伝子の塩基配列をサンガーシークエンスで読んでおります。
得られた波形データにおいて、二つの塩基(AとG)のピークが重なっているところがあり(個体によっては目視で見逃してしまうくらいピッタリ重なっている）、これをA/Gのヘテロ接合と判定しています。しかし、いくつかの個体のDNAでは、Aのピークに、その4分の１ほどの高さのGのピークが重なっている波形データ(面積比4:1)が得られました。これをAのホモ接合なのか、AとGのヘテロ接合なのか判断するのが非常に難しく、大変悩みました。そこでPCRからやり直すと、一部の個体では、Gの波形が消えてA/Aのホモ接合を示したり、2つのピークが重なるA/Gのヘテロ接合を示すといった綺麗な結果が得られたのですが、残りの個体では4回ほどPCRからやり直してシークエンスを行っても、4回ともAとGの面積比が4:1ほどの波形データが繰り返し得られました。これは逆方向から読んだ場合も全く同じ結果になっていました(TとCが4:1)。
PCRの段階でAを持つアレルが偶然多く増幅された可能性も考えたのですが、その上流にある別のSNPでは4回ともピタリとピークが重なるヘテロ接合が見られたことから、どうやらどちらのアレルも同じ量だけ増幅されているようです。シークエンサーの会社のHPや、サンガーシーケンスについてまとめた論文にも当たりましたが、このような現象についての記載はありませんでした。

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