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自動ではありませんが 削除/引用 No.12133-29 - 2024/02/09 (金) 06:38:20 - oyaji FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジーン） なら、結構速いし、安い。トランスフェクションもできます。キアゲンのキットも多少工夫すれば、時短できると思います。 クラボウで自動抽出し、カラムでキレイにする方法もあります。 その他、自動の機械はありますが、機械が高価で、ランニングコストもかかる。 数百クローンやるなら、キアゲンの９６用キット（ただし、DNAの量は少ない）。 １００以下なら、さっさといつもの方法で抽出、あるいはライブラリー化して、グループ（６つとかまとめて）でミニプレップ・・・バイオアッセイを指標として、絞り込む・・・とか、、、。 あとは、本人の生活スタイルと思います。 大きめのコロニーなら、直接制限酵素解析するキットもあるはず。 私的には自作プラスミドで、歩留まりを上げる努力してます。（インサートが入ると、蛍光とか、青白セレクション）　２つ拾えば、大概行けてます。

(無題) 削除/引用 No.12133-28 - 2024/02/09 (金) 00:18:07 - 杏里 チューブを立てるサンプルラックには 　10x10=100本立てられるものを２個用意する。 　臨床検査の自動分析装置用のサンプルカップホルダが使い良い。 ラックにチューブを立てるとグラグラして使いにくいので、 　ラックにアルミフォイルを巻いて、指で１００個の穴を開けたところ 　にチューブを立てると良い。 上清を捨てる時は、デカンテーションではなく、アスピレーターを使う。 　アスピレーターの先には１mL用チップを刺し、その先に20uL用チップ 　を吸い付かせて２段直結で使用し、先の部分だけ交換して使う。 チューブを転倒混和するときは、もう一つのサンプルラックを 　重ねて蓋にして、１００本同時に混和する。 やり方を工夫すると用手法でも効率的に作業することは可能です。

(無題) 削除/引用 No.12133-27 - 2024/02/08 (木) 08:13:32 - マキシ クラボウの機械で取ったDNAはフェノクロ抽出するといつまでも中間層が出て驚いた記憶があるので、モノとしてはきれいじゃないと思っています。お使いの目的に影響がなければ問題ないのかもしれませんが。 アルカリ法自体は連続分注器（www.askul.co.jp/p/U442907/のような安物で充分）を使えば48サンプルでも大した手間ではないという印象ですが、ちまちまカラムを立てるところは面倒ですよね。気をつけていても回収チューブの蓋に触れてしまったりして、個人的にはあのデザインはあまり好きじゃないです。 役に立たない愚痴でした。

(無題) 削除/引用 No.12133-26 - 2024/02/07 (水) 13:03:28 - ema クラボウのって中古とかリサイクルでPI-50は結構出てると思います。うちの職場の他の教室も丁度古いやつ廃棄（動くけど使わなくなった）しようとしている。今売っているのはPI-480だけど試薬とかは同じ。

(無題) 削除/引用 No.12133-25 - 2024/02/05 (月) 21:13:44 - SYBR master >[Re:22] QRPさんは書きました : > 基本的にそうです。すべてアガロースゲルでサイズ確認し、サンガーシーケンスして目的配列に問題ないものをトランスフェクションします。ハズレをもう一度ミニプレし直す時間が惜しいときは2つずつコロニー拾ったりします。 うちはplasmidだとサイズが基本6K越えるものが多く(現在は空vectorでも平均は10K)、電気泳動の時にサンプルに蛍光ダイを先に混ぜておくタイプでは、あくまでAGEの結果は目安程度(DNA濃度で結構ずれる)なので、plasmid取る前にPCRでインサートの有無を確認しています。PCR産物はちょっと処理すれば基本そのままシークエンスにも回せます。一方、low copy plasmidだとミニプレップではシークエンスに回すには量が足りないことが多々あるので、PCR産物の方がシークエンスには使いやすいです(プラトーまで増えたなら、大体の濃度は計らなくても解るので)。 >[Re:6] G25さんは書きました : > クラボウのPIシリーズ、最新機種でも600万円くらい。当時使っていた初期型もそんなもん。 あら意外に安いｗ、けどもう導入する所無いでしょうねぇ〜。NGSが有る時代では、今後大規模なplasmid抽出そのものが殆ど行われなくなるでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.12133-24 - 2024/02/05 (月) 19:22:10 - 独り言 むかしのラボで、クラボウのミニプレマシーンを使いまくってました。 毎週のように、ミニプレしてくれて、助かりました。 ただ、そのころはクローニングがライゲーションだったので、1種類あたり通常4個づつとか、取れないときは10個とかやっていたので、自動化のおかげで24〜48個をやって、当りを補ってました。 現在は、クローニングをライゲーションでなあく、ギブソンにしてからは、1種類あたり2個拾って、大抵当たるので、普通にスピンカラムでやってます（今のラボにはミニプレマシーンがそもそもないですが）。 なので、毎回大腸菌10本もいらない少ない数のため、自動化ではないですが、テクニシャンが毎回さっさとやってくれるので、ある意味、自分的には自動化されてます。

(無題) 削除/引用 No.12133-23 - 2024/02/05 (月) 18:19:52 - QRP おおさん、ありがとうございます。 Wizard MagneSilについては知りませんでした。 ライセートのクリアリングも磁気ビーズでやるっていうところがミソみたいですね。ミキシングや振盪条件を最適化できれば、うまく自動化できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12133-22 - 2024/02/05 (月) 18:01:24 - QRP >24本とか48本とかいうのは、それぞれを独立にトランスフェクションされるのですか？ 基本的にそうです。すべてアガロースゲルでサイズ確認し、サンガーシーケンスして目的配列に問題ないものをトランスフェクションします。ハズレをもう一度ミニプレし直す時間が惜しいときは2つずつコロニー拾ったりします。 基本的に8−9割は当たりなので、手間と時間を考えてコロニーPCRはやりません。

(無題) 削除/引用 No.12133-21 - 2024/02/05 (月) 16:21:53 - おお 私はたいてい４つ拾ったら必ずあたりがあるぐらいにはしてました。反対に入る可能性があるなら８個ぐらいひろうかな。。。 大昔に全然入らないから、コロニーハイブリダイゼーションであたりを見つけたという人がいた。PCRでも見つからんほどの確率やったんかなぁと漠然と思ったが。

(無題) 削除/引用 No.12133-20 - 2024/02/05 (月) 16:16:16 - マキシ 24本とか48本とかいうのは、それぞれを独立にトランスフェクションされるのですか？ それとも歩留まりの良くない難しいコンストラクションだったり、クローニングしてみないと当たり外れを判断できなかったりという問題はあるけれど、コンストラクトが取れてしまえば数クローンのみトランスフェクションに進むという実験なのですか？ 後者であれば、SYBR masterさんがご指摘になっているように、コロニーPCRで数を絞って、然る後に少数をマニュアルで調製するのが簡単だと思います。

(無題) 削除/引用 No.12133-19 - 2024/02/05 (月) 16:10:11 - おお https://promega.widen.net/s/jnxfd69ggs/bacteria-plasmid-dna-wizard-kingfisher-flex-pa386 プロメガの試薬Wizard MagneSil Tfx™ Systemを使ってKingFisher™ Flex Instrumentなどのautomated instrument を使った方法が書かれています。 大腸菌のペレットから作業のオートメーション化に持ち込めるようです。 ゲノムはマグネティックビーズで除くようになっているようで、それが特徴なのかなと。なのでマグネットを底にひいて８連や１２連のピペットを使えば手動でも効率はいいはず。 このキットはエンドトキシンフリーですが、多分そうでないやつが、 https://www.promega.com/products/nucleic-acid-extraction/plasmid-purification/wizard-magnesil-plasmid-purification-system/?catNum=A1630

(無題) 削除/引用 No.12133-18 - 2024/02/05 (月) 15:11:41 - G25 クラボウのPIシリーズ >トランスフェクションには質的に厳しいかも。 一見、純度が低そうだけど（サンプルによっては除去したはずの沈殿のかけらが入っていたり、デフォルトではRNA除去のステップがなかったり）、案外いけた記憶がある。もちろん細胞株種なんかによるだろうけど。 受精卵にマイクロインジェクションするなどデリケートな実験には、さらにRNAase処理PEG沈、あるいはDNAクリーンアップ用のカラムにかけて使ったりはしいたけれど。結局、手作業が加わるなら意味ないじゃんと思うかもしれないけれど、自動で培養液からプラスミドまでやってもらった後にやるだけなら、そういった手作業はそれほど大変じゃない。 もちろん私はクラボウの回し者ではないし、おいそれと導入できるものでもないし、ゴリ押しするつもりもないですが、実際の使用感を申しました。 >PromegaのMaxwell は細胞・組織からのゲノムDNA、RNA精製のシステムで、プラスミド精製はできませんね。

(無題) 削除/引用 No.12133-16 - 2024/02/05 (月) 13:30:49 - もやもや PromegaのMaxwell® RSC48とかはレンタルもしてるみたいですよ。

(無題) 削除/引用 No.12133-15 - 2024/02/05 (月) 12:23:57 - QRP G25さん、誤解してました。スピンカラムよりさらにクラシックな手法ですね。トランスフェクションには質的に厳しいかも。 おおさん、Genscriptのマシンはウェブサイトで見かけたことあります。Midiプレ以上なのと、ライセートを手動で作る必要があるのであれば厳しいですね。企業などで大量のプラスミド精製を必要とするユーザー向けなのでしょうね。 時間もそうですが、それよりも手間ですね。48本やると時間もかかるし、けっこう疲れます。集中力が途切れてサンプルを失ったりもします。QIACubeの40分（実際は1時間？）は許容範囲ですが、4回まわすとなると厳しいかな。2台使えばいいかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.12133-14 - 2024/02/05 (月) 12:23:22 - おお >[Re:12] おおさんは書きました : > https://www.genscript.com/ammag-quatro-automated-plasmid-purification-system.html > こんなんもあるけど、lysate をのっけると言う事なので、前段階でどれくらいの作業がいるか掴みきれていません。 https://www.beckman.com/reagents/genomic/dna-cleanup/emnetik-24-plasmid-purification リンク間違えてました。

(無題) 削除/引用 No.12133-13 - 2024/02/05 (月) 10:55:54 - う 数によります。 高速遠心機にチューブを入れられる数が律速になると私は思っていて、ロボットを買うより、二段でチューブを入れられるローターを買うのが結局一番早かったです。 多分ローターは４８（？）が最大と思いますが、それ以上の数の場合は９６ウエルミニプレップ装置を使っています。 ロボットは時間かかりますよ。

(無題) 削除/引用 No.12133-12 - 2024/02/05 (月) 08:31:11 - おお クラボー使っているラボを見た事があります。片っ端からプラスミドに入れてシーケンスするとかそんな感じのことをやってっいるラボでした。一回に100以上はやってたと思います。 96wellフォーマットで出されているものもあるようです。これで24とかやるときどうするかというのはありますが、、、 手順的なものはよくわからない所もありますが調べてみては、とおもいます。 プロメガから2種類、インビトロジェンから1種類出ているようです。他社もあるかもしれません。 あとマシーンとしては、 https://www.genscript.com/ammag-quatro-automated-plasmid-purification-system.html まあ二時間ぐらいかかっちゃうそうですが、昼を挟むとか、その間に別の実験をするとか、朝早くから培養して、帰る時にセットするとか、工夫はできそうです。 https://www.genscript.com/ammag-quatro-automated-plasmid-purification-system.html こんなんもあるけど、lysate をのっけると言う事なので、前段階でどれくらいの作業がいるか掴みきれていません。

(無題) 削除/引用 No.12133-11 - 2024/02/05 (月) 01:22:18 - あの 次のような過去トピックありました http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?mode=view;Code=3897

(無題) 削除/引用 No.12133-10 - 2024/02/04 (日) 23:12:37 - G25 > スピンカラムキット操作を自動化するという無謀な思想は どうでもいいかもしれないですが、 いえ、Alkali/SDS lysis, phenol 抽出(おそらくグアニジンを加えた変法)、アルコール沈澱です。 遠心機兼攪拌機で沈澱、再懸濁、デカンとで上清除去やトランスファー。フェノール抽出だけど相分離しないmonophasicで不純物を沈澱させ上清を回収する変法で、おそらくグアニジンを含んだRNAzolのような原理。

(無題) 削除/引用 No.12133-9 - 2024/02/04 (日) 22:38:39 - あの 次のようなミニプレップ専用遠心機って、使い勝手はどうなのでしょうか？ https://axel.as-1.co.jp/asone/d/64-3727-77/

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