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(無題) 削除/引用 No.12120-14 - 2024/02/02 (金) 03:11:58 - おお >おおさんは、「全RNAの20%を占めているかも」 もしかしたらマイクロRNAあたりの量だったかもしれません。電気泳動のイメージから推測するとそれよりは多いかもですね。質問されている方は濃度で書かれているので比較できませんが、同じぐらいの容量での濃度ととすると３０から１００分の１ですから普通はありえない数値だとは思います。 カラムの精製時でなにか見落としているところはないでしょうかね。。。エタノールを加えないといけない試薬とか、Qiagenはそうじゃなかったと思うけどbMEを使うときに加えるとか、、、

(無題) 削除/引用 No.12120-13 - 2024/02/02 (金) 00:04:40 - SYBR master おおさんも書いていますが、カラム系とTrizol系の収量を比較して判断するのは、結構大変です。 Tizol系のエタチンでRNAを回収する物は、基本其処にある核酸(DNAも含む）を全部沈殿回収しますが、シリカカラム系のキットは長さ依存的に回収しやすさが出るので、短いRNAは回収できません。フェノール系でRNA抽出した場合、電気泳動で確認できる5S rRNAは、シリカカラム系では基本的には回収できていない(泳動では確認できない）ことからも明らかです。おおさんは、「全RNAの20%を占めているかも」と書いていますが、rRNAやmiRNAを換算すると、OD260の値的には、エタチン使用する場合の50%以上では無いかと経験的には思っています(あくまで経験則で、参考文献は無いです）。 あと、シリカカラム系でRNAを抽出する場合、推奨細胞数を越えたら、急激にRNAの回収量が減るのは経験しています(ほぼゼロ近くになる)。細胞数が推奨越えると、「ゲノムDNAが先にシリカカラムに吸着してしまって、RNA回収量が減る」と、メーカーがは答えてました（たしかQiagenだった)。「どれくらい越えたら、減るのか」は覚えていないのですが、マニュアルに書いてある細胞数を守った方が良いということは覚えています。 余談ですが、もう20年位前になるかもしれませんが、全自動でRNAを取れるマシーンの「評価を行って欲しい」との依頼があってテストしたんですが、カラムでは無く(当時、今もかな)流行のマグネットビーズでの機械でして、収量はODでは計れないくらい悪く、「終濃度がわからない物は、研究では使えない」と、答えたことがあります。「濃度が測れなくてもRT-PCR出来るから問題無い」だろうとメーカー側からは回答ありましたが、根本が解っていない気がしたので、それ以降、おつきあいは無いです。

(無題) 削除/引用 No.12120-12 - 2024/02/01 (木) 05:20:06 - おお >[Re:11] あのさんは書きました : > おおさん　確認させてください： > > ”私の場合はTrizol クロロフォルムで処理後の水相をクロロフォルムで処理してイソパノールで沈殿させてRNAseqに持ち込んだりしましたが全然問題なかったです。” > > > この場合、シーケンス結果に、small RNAが沢山入っていませんでしたか？ > もしかしたら今時のリード量からすると、mRNAの解析には問題が無いのかもしれませんが。 small RNAは入ってます。PolyAをトラップしてからライブラリー作るんではなかったっけ（ターゲットによるけど）。やり方によっては長さの選別をまずしているものもあったような。 でも実際にシーケンシングする人が小さいのが入ってたら問題と言うならそれは従うというふうにはなりますね。

(無題) 削除/引用 No.12120-11 - 2024/01/31 (水) 13:14:44 - あの おおさん　確認させてください： ”私の場合はTrizol クロロフォルムで処理後の水相をクロロフォルムで処理してイソパノールで沈殿させてRNAseqに持ち込んだりしましたが全然問題なかったです。” この場合、シーケンス結果に、small RNAが沢山入っていませんでしたか？ もしかしたら今時のリード量からすると、mRNAの解析には問題が無いのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.12120-10 - 2024/01/31 (水) 09:37:05 - おお >[Re:3] きゃさりんさんは書きました : > →RNA seq用なので出来れば純度の高いRNAを回収したいと考えていますが, Trizolを使って抽出した場合, カラムで精製などする方法があると聞きましたが, よくやる方法なのでしょうか？ 私の場合はTrizol クロロフォルムで処理後の水相をクロロフォルムで処理してイソパノールで沈殿させてRNAseqに持ち込んだりしましたが全然問題なかったです。 もうちょっと詳しく書くとTrizolで一度抽出後（この段階では水相をクロロフォルムで処理する必要はないですが、一応やってます）イロプロで沈殿アルコールでWashし水でリカバーしてDNase I処理を一応してそこにTrizolをぶっかけて再抽出このとき水相のクロロフォルム処理をしておくとフェノールが残って困ることはない。アルコールWashも２回ぐらいやってグアニジンとかキャリーオーバーを低減すればいい。DNase処理の後はその後クロロフォルムしょりだけでもいいと思う。 カラム使わないときれいにならないというけど、意外とやりくりできるもんです。

(無題) 削除/引用 No.12120-9 - 2024/01/31 (水) 08:54:39 - おお >[Re:8] TSさんは書きました : > 一般的に（経験上）、Trizolに比べるとカラムを使ったときの方が通常は収量（OD260での測定）は結構落ちると思います。おおさんがおっしゃっている低分子のRNAも関係してくるとは思っています。 大体２０％ぐらいを１００b以下が占めるという話を聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12120-8 - 2024/01/31 (水) 08:08:02 - TS 一般的に（経験上）、Trizolに比べるとカラムを使ったときの方が通常は収量（OD260での測定）は結構落ちると思います。おおさんがおっしゃっている低分子のRNAも関係してくるとは思っています。

(無題) 削除/引用 No.12120-7 - 2024/01/31 (水) 07:18:24 - あの もう一点気になるのが、Trizolとかなら、ウェル底全部がカバーできるぐらい入れることができて、 マイクロチューブ数本分になっても、抽出作業に入れるけど カラム法だと、1番目の液をそんな感覚で、沢山使えますか？ケチると、RNAの質が悪化するかも。

(無題) 削除/引用 No.12120-6 - 2024/01/31 (水) 03:32:21 - おお >やはり死んでいるというわけではないと考えています。 なにか細胞が付着している以外にエビデンスがありますか？ https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/live-cell-assays/cytotoxicity?wvideo=eqax8np793 Trizolは低分子のRNAも効率よく精製できますが、大抵のカラムによる精製は低分子のRNA（１００b以下）をキャプチャーできません。そこから推測するにRNAの分解がかなり進んでいるのではないかと。電気泳動で流したり、バイオアナライザーで分子量の分布を見たことがありますか？ Trizolで精製したあとカラムにかけて、カラムで回収できないならそういうことでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12120-5 - 2024/01/30 (火) 20:43:48 - ema 昔のマイクロアレイ用の受託をしていましたが Trizol抽出（強い溶解で全抽出）をしたRNAを、量があればRNAeasy mini 量が少ない場合はNucleoSpin microで精製した品質で抽出受託込みでやっていました。 LMDからの精製時にDNase処理時RNAeasyよりNucleoSpinの方がフラグメント化してしまいにくい、という記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.12120-4 - 2024/01/30 (火) 20:42:31 - あの カラム抽出の場合、個人差が出やすいという話を聞いたことがあります。 他社製しか使ったことが無く、そのカラムを使った経験は当方は無いので、どなたかのアドバイスを待ちましょう。 Trizol で抽出したRNAをカラムで再抽出するということはありえます。当方は、RNASeqは受託に出すのですが、当方がRNAsol で抽出したRNAをその受託先は、カラムに通しています。

(無題) 削除/引用 No.12120-3 - 2024/01/30 (火) 20:00:08 - きゃさりん あの様 アドバイスありがとうございます。 ＞組織などを材料として、そのカラムを用いたRNA抽出の経験はありますか？　 ちょっとしたコツを知らずに収量が少ない可能性があります。 →はい, 組織切片からDNAをカラムで回収した経験は多数あります。 また別条件で細胞から今回使用した同じキットでRNAを回収し十分な収量を得ていたこともあり手技的なものは大丈夫かと考えていました。 もしよろしければあの様が重要と考えられているコツなど教えて頂くことは可能でしょうか？ ＞それから低吸着グレードのチップやマイクロチューブを使ってますね？ →はい, 低吸着グレードのチップを使用しています。 ＞なお、 日本ジーンのエタ沈メイトのような共沈剤を使えば、少数の細胞でも、TrizolなどでRNA抽出はできます。 その場合、培養液をウェルから除去したら、すぐにtrizol を入れるぐらいのスピード感があれば、さほど難しくは無いです。 →RNA seq用なので出来れば純度の高いRNAを回収したいと考えていますが, Trizolを使って抽出した場合, カラムで精製などする方法があると聞きましたが, よくやる方法なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12120-2 - 2024/01/30 (火) 19:30:36 - あの 組織などを材料として、そのカラムを用いたRNA抽出の経験はありますか？　 ちょっとしたコツを知らずに収量が少ない可能性があります。 それから低吸着グレードのチップやマイクロチューブを使ってますね？ なお、 日本ジーンのエタ沈メイトのような共沈剤を使えば、少数の細胞でも、TrizolなどでRNA抽出はできます。 その場合、培養液をウェルから除去したら、すぐにtrizol を入れるぐらいのスピード感があれば、さほど難しくは無いです。

カラムにするとRNAが取れない,,, 削除/引用 No.12120-1 - 2024/01/30 (火) 18:02:02 - きゃさりん 初めまして。 表題の件で質問させて下さい。 現在, ある細胞に傷害を加えて遺伝子発現の違いを見る実験を行っています。 day6でRNAを抽出しRNA sequenceに提出する予定です。 細胞数が少なくなるため, Qiagen RNeasy Micro Kitを使ってカラム抽出を行っているのですが, 繰り返し何度やってもRNAの濃度が1-3ng/ulと極めて薄く質も悪く困っています。 細胞障害が強いためなのか, など考えday2で細胞数も調整しながら同様の実験を行っていますが結果は変わらず1-3ng/ul程度でした。 回収時, 細胞は接着している状態で, 細胞周期によって色調の変わる蛍光を発する遺伝子を組み込んだ細胞なので蛍光観察で観察しましたがやはり死んでいるというわけではないと考えています。 以前Trizolを使ったRNA抽出を同じ条件でやったことがありますがその時は100ng/ulほど回収できました。(質はあまり良くなかったですが) カラムで回収しようとするとうまく行かない, といった経験をされた方はおられますでしょうか？ またその際はどのように対応されましたでしょうか？

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