Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

脳切片染色のための抗原賦活化条件について トピック削除
No.12117-TOPIC - 2024/01/30 (火) 04:22:22 - Yuko
普段、マウス脳切片（30µm）をクライオスタットで作成し、スライドガラスに貼り付けた後に染色しています。

今後、抗原賦活化が必要な抗体（Ki67）で染色をする予定なので、賦活化の条件検討を行っています。

これまでに行った賦活化条件は、
@ 70℃で10 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
A 70℃で30 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
B 100℃で10 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
C 100℃で30 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
ですが、どれもうまく染色されませんでした。

賦活化の際のバッファーはクエン酸ナトリウムバッファー（pH=6.0）を使用しております。

また、ブロッキング → 賦活化 → 一次抗体（4℃でON）→ 二次抗体（室温で2時間）→ 封入の順番で行っています。

染色されない原因として、何が考えられますでしょうか。
ご教示願います。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.12117-7 - 2024/02/06 (火) 17:20:46 - てってってー
これは質問の本筋からは外れちゃうんですけど、
賦活化→ブロッキング→抗体
って私はやるんですけど
先にブロッキングから始める方法ってどのくらい一般的なんでしょうかね？

質問の回答として気になった点は
・膜透過処理ってやってますか？凍結切片で特に厚めの組織である場合、クリティカルであることはたまにあるようです
・みさんも書いてある通り、Ki67ってあまり成体の脳になさそうです。そもそも染まるのが正しいんでしょうか？SpleenとかThymus、small intestineなどには多いようですが。

(無題) 削除/引用
No.12117-6 - 2024/01/30 (火) 14:42:34 - み
そもそも生後脳だと分裂細胞なんてレアな出現率でしょうから、他の組織のポジコンを用意しておいた方が良い。
小腸なら陰窩に陽性細胞あるんじゃないですか。
胎児期脳でも良いだろうけど。

(無題) 削除/引用
No.12117-5 - 2024/01/30 (火) 14:06:10 - Yuko
>[Re:3] SNさんは書きました :
> 抗原不活化ではないですが、切片作成後にスライドガラスに貼り付けずにフリーフローティング法で染色を行った方がワークする抗体が多いです。抗原不活化はしていません。
>

SN 様

フリーフローティング法でも試してみます！
アドバイスありがとうございました！

(無題) 削除/引用
No.12117-4 - 2024/01/30 (火) 14:04:40 - Yuko
み様

固定脳をシュークロース置換して凍結包埋しているのでしょうか？

=> はい。書き忘れていましたが、スクロース置換後、OCTコンパウンドで凍結包埋しています。

最近購入した抗体なので、ハズレのlotを引いてしまった可能性はあるかもしれません。

バッファー変えて試してみます。
アドバイスありがとうございました！

(無題) 削除/引用
No.12117-3 - 2024/01/30 (火) 13:29:41 - SN
抗原不活化ではないですが、切片作成後にスライドガラスに貼り付けずにフリーフローティング法で染色を行った方がワークする抗体が多いです。抗原不活化はしていません。

(無題) 削除/引用
No.12117-2 - 2024/01/30 (火) 10:05:46 - み
新鮮凍結切片なら賦活化必要ないことが大半だと思うけど、固定脳をシュークロース置換して凍結包埋しているのでしょうか？
そもそもworkする抗体なのかも心配ですが、クエン酸で駄目ならEDTAですかね。
温度振ったりマイクロウェーブで短時間処理する。

脳切片染色のための抗原賦活化条件について 削除/引用
No.12117-1 - 2024/01/30 (火) 04:22:22 - Yuko
普段、マウス脳切片（30µm）をクライオスタットで作成し、スライドガラスに貼り付けた後に染色しています。

今後、抗原賦活化が必要な抗体（Ki67）で染色をする予定なので、賦活化の条件検討を行っています。

これまでに行った賦活化条件は、
@ 70℃で10 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
A 70℃で30 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
B 100℃で10 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
C 100℃で30 min反応 → 30 min 室温（24℃）で冷却
ですが、どれもうまく染色されませんでした。

賦活化の際のバッファーはクエン酸ナトリウムバッファー（pH=6.0）を使用しております。

また、ブロッキング → 賦活化 → 一次抗体（4℃でON）→ 二次抗体（室温で2時間）→ 封入の順番で行っています。

染色されない原因として、何が考えられますでしょうか。
ご教示願います。
全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。