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(無題) 削除/引用 No.12111-13 - 2024/01/30 (火) 01:11:23 - 鍋 >[Re:6] みさんは書きました : > そもそもWBでAP標識2次抗体を使用している人口自体が無茶苦茶少ないと思うけど、APにする利点何かあるのでしょうか？ > 後学のために知りたいわ。 私の印象としてはフィルム検出の場合はHRPを使って、スキャナーでスキャンする場合にAPを使うという感覚です。スキャナーはHRPでは認識しない、と。最近はフィルム現像の現像液や定着液の廃棄に手間がかかるということで？スキャナー1台学部で買ってみんなでシェアする、ですのでHRPからAPに切り替える、ということに移行してきているかなぁという印象です。

(無題) 削除/引用 No.12111-12 - 2024/01/29 (月) 22:15:37 - G25 > ブロッキングのスキムミルクにアジ化ナトリウムを加えているので、それで納得がいきます。 HRPは反応と共に失活が進むので、アザイドがなくても失活してるのだと思う。 普通の系だと、シグナル強度が足りないと言って反応時間を伸ばしたり、露光をやり直したりしても酵素の失活が進んでいるのでダメです。 スキムミルクのアザイドのおかげかあ、と納得するのは短絡的かもよ。

(無題) 削除/引用 No.12111-11 - 2024/01/29 (月) 21:51:35 - G25 >まずお詫びを申し上げないといけないのですが、実は一次・二次抗体ともに、APではなくHRP標識でした。 ズコー!

(無題) 削除/引用 No.12111-10 - 2024/01/29 (月) 21:17:47 - DSC 半日の間にたくさんのレスを頂き、大変恐れ入ります。 まずお詫びを申し上げないといけないのですが、実は一次・二次抗体ともに、APではなくHRP標識でした。これは単なるうっかりの書き損じです。その点で皆様に議論させてしまい、申し訳ありません。 そして、いくらかの方がお答えくださった「アジ化ナトリウムでHRPは失活する」という点が、私が知りたかった答えだと思います。 ブロッキングのスキムミルクにアジ化ナトリウムを加えているので、それで納得がいきます。 ラボの方々は習慣的にそうしているだけで、それで上手くいく理由を知る人は誰もいませんでしたので、大変役に立ちました。 お騒がせして、申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.12111-9 - 2024/01/29 (月) 18:29:51 - み G25さんご丁寧に有難うです。 そういえば昔AP標識酵素でin situハイブリでやってたなあ。 WBは高感度試薬で大概数分で勝負つくからなあ。

(無題) 削除/引用 No.12111-8 - 2024/01/29 (月) 18:19:07 - うむむ https://www.cytivalifesciences.co.jp/technologies/ecl/pdf/128907_10.pdf 15％過酸化水素in PBSで30分だけでHRPは失活できるらしい。メタノールは不要らしい。

(無題) 削除/引用 No.12111-7 - 2024/01/29 (月) 18:10:18 - G25 APのほうがHRPよりターンオーバーが高いので、感度が一桁くらい高いと言われている。またHRPは反応速度が高いけど寿命が短いので反応時間を長くしてシグナルを蓄積して感度を稼ぐといったことには不向き。 だからより高い感度が要求されるSouthern/NorthenにはもっぱらAPが使われて、HRPは利用されない、もしくは製品化されてもすぐ廃れた。 いまではHRP検出系もいろいろ改良版がでていて、感度を高めたやつとか、ラジカルスカベンジャーかなにかを使ってHRPの寿命を伸ばしてlong exposureが可能なやつとかありますけど、それでも真っ向勝負したらAPのほうが感度がいいと思う。 もっともHRPにはWesternをするには通常十分な感度があり、使い勝手（露光時間の短さなど）もいいので、その点においてはあえてAPでやるメリットは感じないが。

(無題) 削除/引用 No.12111-6 - 2024/01/29 (月) 17:45:21 - み そもそもWBでAP標識2次抗体を使用している人口自体が無茶苦茶少ないと思うけど、APにする利点何かあるのでしょうか？ 後学のために知りたいわ。

(無題) 削除/引用 No.12111-5 - 2024/01/29 (月) 17:02:54 - G25 標識に使うのはCalf intestinine AP（CIAP)が普通ですが、かなりタフな酵素でなかなか完全失活できないもんです。 EDTAや存在下で熱失活なんかすると活性を抑制できるけど、不完全で可逆的という記載もあります。in vitroであればPCI抽出やprotease処理で除タンパク質することが推奨されています。 だからこそ熱処理で簡単に失活できる、北極海産エビ由来のSAP (shrimp AP)が製品化されているわけで。 ということで、「これはウエスタンの常識なのでしょうか？」の答えは否。 ちなみにHRPの失活にはNaN3の他にMeOH/H2O2がポピュラー

(無題) 削除/引用 No.12111-4 - 2024/01/29 (月) 16:30:08 - み ２つの条件がそろわないといけないかな。 ①先に結合させたAP標識２次抗体が失活している（第二検出時に活性が残っていたら再度同じバンドも検出される）。 ②第二検出時に作用させる２次抗体が第一検出時の一次抗体に作用しない（１次抗体の種が違えば簡単に達成できるけど、質問者はmouse-mouseと同種でも上手くいっていると言うから不可解）。 774RさんがおっしゃるようにHRPならアジ化ナトリウムでHRPを失活させるだけで、第一をRbHRPで第二をMsHRPまたはその逆の順番で検出する。 APの場合は何で失活するんでしょうね？ちょっとネットで調べても出て来ん。

(無題) 削除/引用 No.12111-3 - 2024/01/29 (月) 14:30:40 - あ 普通、２回目にやるのはローディングコントロールのウエスタンブロットで、GAPDHとかアクチンとかだと思いますが、抗体とAPのシグナルが非常に強いので、１回目のAPシグナルが無視できるからではないですか？

(無題) 削除/引用 No.12111-2 - 2024/01/29 (月) 13:31:34 - 774R 2次抗体の動物種が違う場合、HRPならアジ化ナトリウムで不活化させればストリッピングは不要ですが、質問者のケースではどうなのでしょう・・・ 何らかの理由でAPが失活してるんじゃないですかね？ これが一般的だとは思いませんが。

ウエスタンで2つ目のターゲットの検出 削除/引用 No.12111-1 - 2024/01/29 (月) 13:19:04 - DSC 既出かもしれませんが。 既に1つのターゲットを検出した後のウエスタンブロットについて2つ目のターゲットを検出する際、二次抗体が異なる場合はストリッピングが不要なのは何故ですか？ 私がいる研究室では、ウエスタンで抗原Aを抗マウスIgG二次抗体で検出した後、同じ膜で抗原Bを抗ウサギIgG二次抗体で検出するとき（または1回目抗ウサギ・2回目抗マウス二次抗体の場合も）、2つの検出の間に行うのはブロッキングのみでストリッピングは行いません。 それで抗原Bの検出の際に抗原Aのバンドは現れないのは何故ですか？ 各二次抗体に標識されている酵素は同種（AP）です。 これはウエスタンの常識なのでしょうか？ それともすべての場合に適用できるわけではないのでしょうか？ ご教授頂けましたら幸いです。

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