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(無題) 削除/引用 No.12107-11 - 2024/01/27 (土) 12:42:54 - おお >[Re:9] ドリブンさんは書きました : > おおさん > ご連絡ありがとうございます。 > > Qカラムの溶出の際の塩濃度が違う点です。 プロトコールもどせないものなんですかねぇ。。。 QでやったのならDEAEにしてみると若干特性も変わるので違う分離の挙動を示すとおもう。

(無題) 削除/引用 No.12107-10 - 2024/01/27 (土) 12:10:38 - あの 本当に分解なのか、凝集や吸着ロスの可能性は無いのか、が疑問です。

(無題) 削除/引用 No.12107-9 - 2024/01/27 (土) 11:18:00 - ドリブン おおさん ご連絡ありがとうございます。 先輩のプロトコルではゲルろ過カラムにかけた後Qカラムにかけて精製しております。私の実験との相違点は大きく2点あり、ゲルろ過カラムの種類が違う点とQカラムの溶出の際の塩濃度が違う点です。ゲルろ過カラムの方は耐圧性の観点から教授があまり使用したくないらしく、現在のままで行こうと思うのですが、Qカラムのグラジエントについては再度考えてみます。 逆相カラムを使うことは確かにありかもしれません。ただ、アミロイド線維形成の結果に影響があるかもしれない点が悩みです。 透析膜は研究室所有の中でカットオフサイズが最大のものを使用しております。 組み換えタンパク質を使用した実験が初めてであまり感覚がないのですが、不安定なタンパク質でも翌日に分解してしまうのは早すぎるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.12107-8 - 2024/01/27 (土) 10:18:10 - ドリブン あのさん ご連絡ありがとうございます。 実験時はいつも4℃下で操作しております。基本的には低温で急速に実験を行っております。 先輩の使用していたタンパク質阻害剤が具体的に何かまでは把握しておりません。申し訳ありません。 透析後は減圧乾燥して、HClを添加することでアミロイド線維形成を行う予定です。アミロイド線維形成とチオフラビンT蛍光を測定する際に塩の影響があるかもしれないので、DWに透析したいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.12107-7 - 2024/01/27 (土) 04:03:59 - おお >※先輩の再現性をとる必要があり、 やったことがある人がいるならその人に聞くかノートなど実験のヒストリーを調べてみるべきではないでしょうか。 >どのカラムを選択すれば Straight forward な解決方法はやはりプロテアーゼ阻害剤か精製するかだと思います。一度変性させることができるならそれもあり得る方法かもしれません。精製度がCBBなどの染色でよく見えても意外と潜んでいるプロテアーゼにやられてしまうということはあるみたいです。 陰イオン交換かゲルろ過カラムですね。場合によっては疎水カラム、HAP、ヘパリンなど。ただ吸着してしまう場合もあるとは思いますが、その蛋白の精製過程のレジンは何を使っていたのかである程度支持体など選ぶのに参考になるとおもう。 また、その蛋白を精製したカラムにもう一度かけてWashの条件や溶出の条件を変えるだけでもいくらか効果は期待できる。 数kDaぐらいの逆相で精製できそうなものであればそれもありかもしれませんが、強酸性、有機溶媒にさらされるので一般的とは言えない（プロテアーゼの変性は期待できる）。 陰イオン交換のばあいDEAEかQAEどちらでもいいと思います。 ゲルろ過は脱塩目的だけのやつ（G-25とか）もありますが、サイズによる分画ができると精製できますから、そういうカラムを使えばバッファー置換と精製を同時にできると思います。が、DWとかだとちょっと吸着しないか気になりますね。その場合はPBSで精製して透析でしょうか。欠点は若干ボリュームが増えて薄くなります。濃縮が必要なら、その蛋白を精製したときに使ったカラムにつけて完全に外れる条件で溶出すれば（支持体への相互作用がなければ）一気に溶出され高濃度になることが期待できます。 場合によっては発現のところか見直したほうがいいかもしれません。例えばCell free systemなら転写、翻訳に必要なものの抽出物を使うので大腸菌内のプロテアーゼもかなり脱落しているように思えます。大腸菌で発現させる場合も培地で変わったりもするらしいです。M9 minimal mediumとかだとエンドの蛋白も色々発現的に抑制的のような気がします。 あと透析膜のカットオフサイズを目的の蛋白が出てこない程度に上げると余分なものが出ていきやすくなるという発想もあると思います。透析も速くなるかな？という期待も。１や３kDaとかでやっているなら、１０kDaにするとか。それでうまくプロテアーゼ活性を除くことができるなら、まず外液をPBSにしてプロテアーゼ活性を十分下げてからDWに切り替えるとかもありかもしれません。 しかしなんのバッファー効果もないDWなんですか、、、それとまさかだけど使っているDWにプロテアーゼ活性があったりとか、、、はないか、、、それならオートクレーブした水を使うか、、、レンジで一度ボイルするだけでも変わるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12107-6 - 2024/01/27 (土) 01:11:57 - あの 透析した後には、どういう目的で使用するのですか？ それにより方法がかわりえます

(無題) 削除/引用 No.12107-5 - 2024/01/27 (土) 01:10:12 - あの 低温にしていますね？ 用いたことのあるタンパク分解酵素阻害剤は具体的には何ですか？色々あるので

(無題) 削除/引用 No.12107-4 - 2024/01/26 (金) 23:39:26 - ドリブン qqさん ご質問とご提案ありがとうございます。 プロテアーゼのコンタミが分解の原因の一番だと考えています。 本来であれば、プロテアーゼを取り除くことが最善でしょうが、どのカラムを選択すればいいか悩んでいます。精製純度は十分なので、そのまま解析に持っていこうとしていました。 大腸菌はDE3系統のLON欠損の発現用大腸菌です。 DW透析の際に起こる分解は限定分解で毎回きれいに2本に分かれます。分解後のバンドの位置も毎回同じです。 ＜提案について＞ １）適当そうなタンパク分解酵素阻害剤を入れてみる。 →以前先輩がやっておりあまり効果的ではありませんでした。 ２）透析外液を頻繁に交換して、透析時間を短縮する。 →これはまだ試みたことがないので挑戦してみます。ありがとうございます。 ３）ゲルろ過で脱塩する。（ゲルにタンパクが吸着するかもしれないけどね） →研究室として所有しているか不明ですが、教授と相談してみます。 改めて、ご提案ありがとうございます。非常に勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.12107-3 - 2024/01/26 (金) 22:15:51 - qq 質問に質問です。 非常に分解しやすいタンパクというのは、それがプロテアーゼであるということ？なのでしょうか？ それとも、なにかプロテアーゼがコンタミしていると考えているのでしょうか？ 大腸菌は普通にDE3系統のLON欠損の発現用大腸菌ですよね？ 分解したタンパクは、限定分解なのでしょうか、それともズタズタになっているのでしょうか？ そして、役に立ちそうにない提案です。 １）適当そうなタンパク分解酵素阻害剤を入れてみる。 ２）透析外液を頻繁に交換して、透析時間を短縮する。 ３）ゲルろ過で脱塩する。（ゲルにタンパクが吸着するかもしれないけどね） ４）対象がプロテアーゼなのであれば、活性中心を潰してしまう。（取る意味ないか？）

組み換えタンパク質の分解について 削除/引用 No.12107-1 - 2024/01/26 (金) 21:06:19 - ドリブン 初めて投稿します。 大腸菌発現の組み換えタンパク質を精製した後、DWによる透析の段階で分解します。もともと非常に分解しやすいタンパク質です。DWに透析する際のコツがあればご教示願いたいです。 以下に現状をざっくりと説明させていただきます。 ※PBSからDWへ透析する際に分解してしまう。 ※十分に透析する必要があるためDWへの透析の時間を減らすことは難しい ※DW中で遠心をするとロスしてしまうため、限外濾過による遠心脱塩は難しい ※先輩の再現性をとる必要があり、DWへの透析を変えることは難しい 所属研究室でDWによる透析をする者がおらず、皆さんの知識を伺いたく投稿させていただきました。また、見落としている点があればご指摘いただきたいです。何卒、よろしくお願いします。

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