BioTechnicalフォーラム [サイクルシークエンスで解析できない塩基の決定方法]

サイクルシークエンスで解析できない塩基の決定方法

No.1210-TOPIC - 2012/12/01 (土) 17:16:10 - M1. tanaka

先日Genetic analyserを用いて、大腸菌からミニプレしたプラスミドのシークエンシングを行ったのですが、数カ所で2種類の塩基のピークが重なり合い(重なってるのは1塩基分のみ)、判別できないケースがでてきました。
コンタミを疑いサブクローニングを行い再度複数のクローンでシークエンスを行いましたが全く同じ現象がみられました。
先輩等に相談したところ、おそらく今のプログラム、モジュールでは判別できないと言われ、別の方法で塩基の決定が出来ないか考えています。
とりあえず考えているのが
①重複している2種類の塩基に対応する塩基を3'末端に付加したプライマーを用いてPCRを行い、上手く増えた方が正しいと判断する
②ちょうど重複部分で切れる制限酵素を調べる
③インヴァースPCRで無理やり正しい配列にする
です。
①については検討を行ったのですが最近のポリメラーゼは多少のミスマッチは難なく校正してしまうようで、両方増えてしまいました。次は条件を厳しくして再度検討したいと考えていますが、どうもうまくいきそうにないです。
上記の方法以外に塩基を決定できるいい方法があればご意見頂きたいです。
よろしくお願いします。
　

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No.1210-13 - 2012/12/05 (水) 01:30:01 - おお

解決になるのかわかりませんが、インサートが切り出せないならインサートをPCRして、そのフラグメントをゲルから精製してシーケンスする手はあるかと。プライまーをシーケンス用に複数作っているようですから、それを使えばPCRできるのではないでしょうか。サイクルシーケンスの条件を少し厳しくするとか、テンプレートの量を多くするとかで、S/N比を改善できる可能性はあるかと思います。サイクルシーケンスの反応溶液を1/4にケチれるそうですが、読みにくいものはあまりケチらないでやってみるとか。

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No.1210-12 - 2012/12/05 (水) 01:04:27 - aji

インサートがcDNA由来で1kbp程度と分かっていて、読めたのが600bp、だけどベクターの配列が分からないというのがいまいち納得いかないのですが、譲り受けたものであれば提供元にベクターの配列は聞けるのではないでしょうか。

cDNAからクローニングしたのが別の人で、もらった時点で一種類のプラスミドダイマーになっていればそこから大腸菌に入れなおして何クローン拾っても同じであるはずですよね。

目的にもよりますが、そのベクターを使わないといけないのでしょうか？

他のベクターで使うか、配列を読むのが目的で、プラスミドダイマーかリピート配列だった場合、目的部分をPCRで増やして新しいプラスミドに入れれば基本的に2種類のクローンが得られるでしょうし、またシークエンサーで同じような重なったデータになればシークエンシングの問題になるのでABIに相談。

今のベクターのまま使うならそのまま使うか作り直すなら元のベクターを手に入れる必要があるわけで、結局は提供元との相談になるでしょう。

そこの情報収集はするとして、結局次に何をするかなので、配列確認と次の作業が兼ねられる手法を選ぶのが近道のように思います。

(無題)

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No.1210-11 - 2012/12/05 (水) 00:15:55 - M1.+tanaka

皆さんレスありがとうございます。
遅くなってしまい申し訳ないです。

Harmoniaさんからご指摘があったので詳しい説明を・・・
プラスミドは譲り受けたもので、長さがよくわかっていません。
インサート(cDNA)の長さは1kbほどです。
プラスミドの配列も分からないので、制限酵素でインサートのみを切ってやることは難しいです。
プライマーで読めた長さは600程で、問題の箇所は200か300くらいの場所で一番きれいに読めてる所でした。
重なった後のピークは綺麗なシングルピークです。

もし仮にプラスミドダイマーだった場合は、cDNAを切り出して別のベクターに移し替えるなりすればいいと思うんですが、ダイマーの見分け方がどうしても思いつかないです。monさんがおっしゃるようにモノマーと一緒に流せば分かるかもしれないんですが、今あるすべてのクローンが同様のダブルピーク(？)を示しており、コントロールとなるサンプルがないです。。
・・・書いてて思ったんですが複数のクローンでダイマーが形成されるなんて確率論的に滅多に無いんじゃあ無いでしょうか？？
大元のグリセロールストックにダイマーが含まれていたとしたら起こりえるのでしょうか・・・

それはそうとして、順序としては
①ダイマーが原因なのかシーケンサーの問題なのかはっきりさせる
②ダイマーなら、分離するなり別のベクターに載せ替えるなりする
③シーケンサーの問題なら、別のキットで試すか、おおさんのおっしゃるように塩基配列ごとのシグナルの強弱から問題の部分の塩基を予想する、ABIに相談する。配列を無理やり直す

ていう感じで考えてますが、①の判断がどうにも難しいです。。

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No.1210-10 - 2012/12/03 (月) 10:19:04 - 名無し

シークエンスデータの正確性を疑うのなら転写シークエンス（CUGA®シークエンシングシステム）を併用するという方法もありますね。

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No.1210-9 - 2012/12/03 (月) 10:00:14 - mon

説明不足ですいません。"plasmid dimer"の意味は、insertだけのdimerではなくvector backbone+insertのdimerです。
この場合片方のinsertに変異があると、トピ主さんのようにクローニングで分離出来ないけど、vectror primerでのシークエンシングすると、(裏表どちらも）その変異部分のみ2重の波形になる、ということが起こりえます。
分離するには、一カ所切断してself-ligation・再クリーニングすれば良いです。
plasmid dimerは制限酵素で切断するとmonomerと同様に泳動されますので、切断せずに流すとdimerとmonomerの泳動距離が違いますので判断できます。

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No.1210-8 - 2012/12/02 (日) 20:18:27 - Harmonia

両側でもということから、プライマー2種類で読んでいるようなので、
そもそもインサートの長さは？
複数の制限酵素でインサートを切り出したとき、バンドの長さと濃さに整合性
がありますか？（ダイマーならサイズの割に濃いはず）
それぞれのプライマーで読めた長さは？
読めたうち、何塩基目がピークが重なりますか？
重なった後のシグナルはシングルピークですか？

解析結果の画像を見せていただければ色いろ語れそうですが、文字情報しか
ここではやり取りできませんので、詳しい状況説明がほしいです。

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No.1210-7 - 2012/12/02 (日) 10:11:54 - mon

Plasmid dimerかな？

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No.1210-6 - 2012/12/02 (日) 01:48:45 - おお

もう忘れてしまったんですが、塩基配列によりシグナルの強弱がかわります。たとえばGのあとのAは弱いとか(たとえ話なのでGのあとのAは弱いといっているわけではないですけど)。そう言うことを加味すると可能性の高い塩基を抽出できるかもしれないと。

ピークが重なるのがバックグランドであれば、シーケンスの反応を工夫するとS/Nを改善できる可能性はなきにしもあらずですが。

正しい配列に直すといっても、直してもいいでしょうけど、根本的な解決になってないかもしれません。サイクルシーケンスの歴史は長いですから、ABI(でしょうか)にデーターを見せて相談してみるのもいいかもしれません。

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No.1210-5 - 2012/12/01 (土) 23:56:20 - 直輝

・外注でシーケンスしてみる
⇒読みにくい配列を読むノウハウを持っているかも

・インバースPCRで、アミノ酸は変えないようにコドンを変更

とか、どうでしょう？

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No.1210-4 - 2012/12/01 (土) 23:25:59 - 通りすがり

たまに何度読んでも近接するピークに出会うことがありますが、逆読みしても同じというのはあまりなかったような。不思議な話です。解析モードを変えると多少は位置がずれますが、改善されなければ、別のキットで読んでみるのが一番簡単かな。

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No.1210-3 - 2012/12/01 (土) 22:51:51 - M1.+tanaka

＞＞橘さん

はい。両側から読んでも同じ結果でした。
また、少し離れたところから伸びるプライマーを用いても同様でした。。