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(無題) 削除/引用 No.12099-8 - 2024/01/28 (日) 16:35:03 - toto 培養細胞の場合、サンガーでのdirect sequencingはさすがに厳しいですね。TAクローニングでは何個拾えばいいのかわからず時間と手間もかかるので、今ではナノポアの1択でしょう。クローンが1２個までならbarcodeつけてlibrary調製２時間、run１時間くらいで十分です。いつもやってるところだと費用もしれてます。プロトコール通りにやれば２−３万にはなるかもしれませんが、実際には大幅に安くできます。近隣にだれかおられるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.12099-7 - 2024/01/28 (日) 11:37:20 - eee 実験を進めていたら、deletionが起きていそうなことは分かったのですが、2重に見える複雑な配列を読み込むと、それだけではなさそうなことがわかってきました。基本的には、TAクローニングで読むか、NGSでWESを読むという形になるのでしょうか。 deletionの位置から、波形が2重になり、その後ある地点で、deletionだけでは説明のできない配列がありそうです。もしこの変異が、deletionとは違う対立遺伝子にあるなら、homoでの変異が1回の実験で検出されたことになります。 他に何かアイデアありますか。TAクローニングだと、PCRのアーティファクトを拾う可能性もありますか？

(無題) 削除/引用 No.12099-6 - 2024/01/25 (木) 10:56:56 - AA >Cas9の効率 先にご指摘のある通り、Cas9が働いてDNA切断を行うかどうか、という意味合いでの効率であればかなり高い数値が期待されます。実験によっては90%を超えてもおかしくありません。 Cas9切断が起きる効率がもし20％ならそれは実験系の問題を疑うべき数字です。 一方で、2cutして領域を切りたい場合など、Cas9での切断が起きてから更に別のイベントを期待する場合は話が変わります。 DNA修復のパターンの大部分はDSBが生じた直後にその場で起こるNHEJですので離れたDSB同士でのNHEJの場合はかなり効率が落ち、これも指摘のある通りですが、数十bp程度のhomology armを持ったドナーを入れるなど効率を上げる工夫が必要です。 私も患者型の染色体欠失を再現しようとMbp単位の欠損をしようとしたことがありますが、効率はヘテロが生じる割合でもだいたい1%くらいでした。 発現カセットのノックインなどでも1%くらいと言われる事が多いと思います。

(無題) 削除/引用 No.12099-5 - 2024/01/25 (木) 01:02:22 - eee 培養細胞で、20%はかなり効率がいい方なんですね。。。 Cas9は50%以上の効率があるのかと思っていました。今回、sgRNAのトランスフェクションは一過性なので、さらに効率が低いのかもしれません。 ホモでKOが得られない場合は、再度その細胞で、Cas9処理を行うことになるのでしょうか。 一応deletionに見えるものがあるのですが、そもそもsgRNAの位置には全く変異はありません。

(無題) 削除/引用 No.12099-4 - 2024/01/24 (水) 19:53:57 - asan >dual sgRNAの間が500bpくらいなので、それを挟むように700bpでPCRして、シークエンス解析を行ったのですが、評価が難しいです。 何をどのような精度で評価するかによります。 >複数のクローンで全く同じinsertionが入っているように見える箇所があったのですが、dual sgRNAで全く同じ変異が入ることはあるのでしょうか。 dCasとか使ってなければそれぞれのsgRNAでindelがしょうじますからその可能性の数だけ複雑になります。 DSBが生じたあとのNHEJによる修復でindelが生じることでKOするのが通常のknockoutですが、切断箇所付近のマイクロホモロジーなどの関係で切断後のindelが偏ることはあります。場合によっては3Nフレームシフトばかりということもあります。 マウス受精卵でやると、F0世代では結構モザイクができますし、deletionをやっただけだと逆向きに組み変わったものとか結構でてくるって発生工学の部署が発表してました。 ジェノタイプのしやすさも考慮すると、KOでもssODNを組み合わせてKIベースでKnock outを前提に作った方が確実でいいって言ってます。 培養細胞の場合は、Knockoutカセットのノックインなどでやる場合もありますが（ESとか）、KI効率は悪いので基本的にはsingle sgでもクローンをたくさん取って気合いでWベースでタンパク質発現を指標にしてKOを探すのがなんだかんだ手っ取り早いです。 >ヘテロとホモの区別もなかなか難しいです。 多くの不死化された癌細胞の場合はアリルの異数性が生じていて染色体が2でな苦なってる場合も結構あります。 ＞みなさんどうやって評価していますか。 目的によります。 ＞そもそもCas9の効率は5-70%とのことですが、みなさんもそんな感じでしょうか。 単一のindelだとそのぐらいです。 dCasとか複数のsgRNAでsmall deletionを行なった場合に20%以上取れるのは結構効率がいい印象です（培養細胞）。 KOつくるだけなら500bpsも距離を離す必要はないと思いますので、数10merでいいと思います。　KIの効率がいい細胞ならssODNを組み合わせてsmall deletionを揃える場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.12099-3 - 2024/01/24 (水) 18:02:32 - AA >複数のクローンで全く同じinsertionが入っている これは経験上の感覚ですが割とこういう事はあると思います。 入りやすい配列には何らかの傾向があるのかもしれません。 >ヘテロとホモの区別 脈絡的にソーティング後にクローン化してから解析しているのかと思いますが、クローン化してもホモヘテロの区別ができないとなるとそもそもシングルで分取できていないのではという気もします。 2箇所の切断点同士でつながるパターン、個別にindelが入るパターンがあるので産物長自体はまちまちになりますが、バンドパターンは元の株が持ってるアリル数以上になることはないと思います。 私がやるならまず単純にバルク(TFしたディッシュまるまるからDNA採取)で予備実験をして短いバンドが出やすいガイドを選定し、それらについてFACS なり抗生物質なりで選択圧をかけてクローニング。増えたコロニーからゲノムをPCRで判定、欠損っぽいやつをシークエンスして確認、です。 たいていの場合いきなりホモKOにはなりません。(この場合のKOはindelではないlarge deletionのことです) 対立アリル側でNHEJで認識配列が壊れている事が多いのでシークエンスを確認し再度別のガイドを用意して実験をしホモ化します。 波形解析についてはいわゆるTIDE解析ツールでいくつかソフトがあります。(TIDE/ICE/DECODR/TIDER.etc) indelでフレームシフトが起きる場合の解析ツールで、非常に強力で便利なツールですので私もよく使用します。 ただ、サンガーシークエンスの波形同士を比較する性質上、dual cutで大きく欠損させたい場合の解析にはあまり向いていないかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12099-2 - 2024/01/24 (水) 13:18:29 - おお 重なった波形から両者の配列を抽出するソフトがあったと思いますが、それで配列が決められたとして、それだけじゃだめでしょうか。

Cas9 KOの評価をシークエンス解析で行う。 削除/引用 No.12099-1 - 2024/01/24 (水) 11:11:17 - eee Cas9 KOをdual sgRNAでトライしています。 具体的には、Cas9 expressing cellにdual sgRNA plasmidをトランスフェクションして、赤色の蛍光のあるものをsortingして,培養。WBとシークエンス解析で評価しています。 dual sgRNAの間が500bpくらいなので、それを挟むように700bpでPCRして、シークエンス解析を行ったのですが、評価が難しいです。 複数のクローンで全く同じinsertionが入っているように見える箇所があったのですが、dual sgRNAで全く同じ変異が入ることはあるのでしょうか。 ヘテロとホモの区別もなかなか難しいです。 みなさんどうやって評価していますか。 そもそもCas9の効率は5-70%とのことですが、みなさんもそんな感じでしょうか。

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