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(無題) 削除/引用 No.12092-4 - 2024/01/19 (金) 22:45:23 - SYBR master >[Re:1] TA cloningさんは書きました : > と思い至りましたが、その考えは間違っているでしょうか？ T4 DNA ligaseはそもそもblunt-endでもligationできるくらいfidelityに関してはおおざっぱな酵素なので、突出末端ではない物でも環状化してしまいます。また、本当にどうやってつなげた？みたいな物も取れるくらいなので、ネガコンはあった方が良いです。しかし、cloning出来た物を探すだけなら、colony-PCRを組み合わせれば出来ます。targetがcloningされたら増える条件でね。 個人的には、Blue/whiteのカラーセレクションは、PCRが流行る前の手法なので今ではあまり使用していません(X-galは結構高価だし）。入ったかどうかは、vector側にあるprimerサイトを利用したcolony-PCRで検定するので。 ただ私は、古いキットを利用する場合、ネガコンは時間の短縮のためには必須だと思いますよ。上手くいっているか、行っていないかの判断を、transformationの結果だけで判断できるので。

(無題) 削除/引用 No.12092-3 - 2024/01/19 (金) 17:35:10 - G25 >コロニーはそもそも生えないので青白セレクションはそもそも必要なかったりするのでは？ バックグラウンドのコロニーは出現し得ます。 dTの付加をしそこなったりd突出が削れたり、そもそも制限酵素で切れていなくて環状のままのプラスミドが夾雑しているかもしれない。 しかし、それが青いか白いか見るのは何か役に立ちますか？ 何を評価するための陰性対照ですか？　 それが説明できないんであれば、なんいせよ意味のない対照実験でしょう。

(無題) 削除/引用 No.12092-2 - 2024/01/19 (金) 16:15:19 - おお >[Re:1] TA cloningさんは書きました : > お世話になります。 > > ラボに古いTA cloningキットがあったので、使ってみたいです。 > ただし青白セレクションをするための試薬がないため、困っています。 試薬がないってネガコンがないってこと？それとも他の試薬？Xgalとか? > > 一つ疑問は、PCR産物を加えない限り、リニアなpCR2.1ベクターは環状にならないためコロニーはそもそも生えないので青白セレクションはそもそも必要なかったりするのでは？ バックランドがいくらか出ます。インサートによっては難しい場合ポジとバックグランドの比が下がってきます。まあ必要ないといえばよほどのことがない限り必要ないとも言えるでしょうけど。

TA cloning kitのネガコン 削除/引用 No.12092-1 - 2024/01/19 (金) 15:39:24 - TA cloning お世話になります。 ラボに古いTA cloningキットがあったので、使ってみたいです。 ただし青白セレクションをするための試薬がないため、困っています。 一つ疑問は、PCR産物を加えない限り、リニアなpCR2.1ベクターは環状にならないためコロニーはそもそも生えないので青白セレクションはそもそも必要なかったりするのでは？ と思い至りましたが、その考えは間違っているでしょうか？

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