全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1208-12 - 2012/12/03 (月) 21:50:38 - Harmonia ほぼ結論が出ているようなので、言わなくても良いかとも思いましたが．．． No.1208-9 で KYさんが仰っていますように、たとえば同じ量のタンパク質が あったら、核に局在するときと細胞質に局在するときでは、シグナル（光り方) が違います。 かりにトピ主さんの見ている細胞で、２次元画像で見たときの核と細胞質の 面積比が１：１０なら、細胞質の光り方は1/10になっていて、光っていない と思うかもしれません。 ＞免疫染色では発現がみられないのに、westernでは上昇していることはあるのでしょうか。 ＞実は、病気の部分の免染で細胞質の染色がうっすらとあります。 ということは、説明がつきます。 皆さんがおっしゃるように、Westernも全細胞ではなく、可能なら核分画と 細胞質分画それぞれで行い、正常と病気で細胞内局在が変わることを言えば とっても興味深い論文ができます。

(無題) 削除/引用 No.1208-11 - 2012/12/02 (日) 19:11:16 - とりさん まっくろんさん KENさん KYさん 矛盾さん おおさん ありがとうございます。 申し訳ありません。実は、病気の部分の免染で細胞質の染色がうっすらとあります。核はネガコンと同じように、染色がありませんでした。 この結果は病気の部分では、核から細胞質、細胞外にたんぱく質Aが放出したという、一つの可能性として言えるでしょうか。 m-RNAの発現上昇は細胞外漏出に対する補完応答の可能性もありますよね。 免染で、病気の部分のシグナルが減ることは、やはり健康の部分とは違うと思いました。 いずれにしても、核分画のウエスタンは上司にやり方を聞いてやってみたいと思います。 ところで、たんぱく質Aの抗体はよい抗体です。モノクローナルです。培養細胞も染色できましたが、蛍光染色はわかりにくかったです。シグナル強度の解析までは行っていませんが、やはり核ですごく光ってました。 免染とwesternで結果が違うこともあることがわかって大変勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1208-10 - 2012/12/02 (日) 11:21:03 - まっくろん 「核は染まらず〜」という記載だったので、それ以外はと思い、投稿したのですが、細胞質でも染まってないのですね。そこや細胞外が染まっていれば、比較的きれいに説明できそうなのに、もどかしいですね。 私もKYさんがおっしゃるように、核分画のウエスタンをしたらどうかと、思います。正常組織と病変組織の核タンパク質をウエスタンし、違い(病変組織で発現が低下する？)が確認されれば、少なくとも核外に出ているという説明ができるような気がします。mRNAの亢進は、細胞外漏出に対する補完応答(そういう反応があるかはわかりませんが、仮説として)など考えられませんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1208-9 - 2012/12/02 (日) 05:41:32 - KY そのタンパク質Aは細胞質に存在する場合でも良好にその抗体で検出できるのでしょうか？培養細胞などではうまく染色できるのでしょうか？ 核よりも細胞質に存在するほうが濃度が薄くなるので、細胞質にあるタンパク質Aを検出できていないのではと思います。 生化学的に組織を核分画して、ウエスタンすればはっきりすると思います。

(無題) 削除/引用 No.1208-8 - 2012/12/02 (日) 01:21:42 - おお >[Re:5] とりさんさんは書きました : > おおさん > 抽象的な質問で大変申し訳ありません。 > > 「さまざまな論文を見ますと、病気の部分は免染で発現が上昇した、という記述と、発現がなかったという記述と両方見られます」 > > →免染において、「病気の部分では核に局在のある細胞数が増加した、という記述と、逆に核に局在のある細胞数が減少した」という記述になります。 > > > たんぱく質だけしか見ておらず、まだシグナル分析まで至っておりません。 シグナルというのは免疫染色で染色されてintensityのことをいっています。リン酸かとかで下流に伝達されるようなシグナルではなくて、たとえばIFなら染色された蛍光の強さとかです。 発現量に関してはWB中心に語ればいいかと思います。その状態であなたの使った抗体は組織を染色した場合どんな結果になったか、他の文献と比べて何が違うのか(抗体、固定方法、、、)、、、など考えればいいでしょう。そこでその抗体での組織染色の評価なりが必要ならそれを加えればいいし、その抗体の組織染色の結果では満足いかないなら、違う抗体を使ってみるとか考えてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1208-7 - 2012/12/02 (日) 00:49:37 - KEN WBとIHCで結果が異なることはあります。 確認ですが、WBでは発現が高いのに、IHCでは核のみならず、細胞質への染色性は認めないということでいいんですよね？ 一つ、質問ですが、抗体はモノクロですか？ポリクロですか？ 認識部位のAAの長さはどのくらいでしょうか？ ほかの方が書かれていないことで、ぱっと思いついた可能性は たとえば、ProteinAに変異が入ると考えた場合(多くは上流か下流がおかしくなっていたりし、そんな明快に行くことは少ないですが)、抗体が微妙に反応しづらい状況が発生しているかもしれません。 抗体濃度を下げると反応しなくなるが、抗体濃度が高いと反応してしまう。という状況であれば、WBでは抗体濃度が高く、MutのProteinAともintactのProteinAとも反応しているが、IHCでは、抗体濃度が低めなので、MutAとは反応せず、intactAとのみ反応している可能性があるかなと。 よって、WBももう少し抗体濃度を下げて正常組織と以上組織で比較もしくは、複数の認識領域の異なる抗体を用いて比較してみたい気もします。 論文によって、反応した、反応しなかったと騒がれているとき、多くは抗体濃度や賦活法によることが多い気がしますが、いかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1208-6 - 2012/12/01 (土) 20:50:08 - 矛盾 >病気になると細胞の核から細胞質を経由して、細胞外に放出されます。 >さまざまな論文を見ますと、病気の部分は免染で発現が上昇した、という記述と、発現がなかったという記述と両方見られます。 この二つの表現が、根本的に矛盾していると思いますが？　いかがでしょう。　匿名の分子の話ですから、ここに矛盾があると、回答者側もよく答えられないと思います。 ウエスタンと組織免疫染色の結果が矛盾することはよくあることです。その原因は、ウエスタンのサンプルを調製したときに、取りこぼしがあるとか（不溶性）、抗原性が局在化の違いで変化するとか。 固定がしっかりいっていれば、私は組織免疫染色のほうが信頼できることが「多い」と思います。また、組織免疫染色で、細胞外部分の染色がどうなっているか？　もしかしたら、面白い発見につながるかもしれませんので、注意してください。

(無題) 削除/引用 No.1208-5 - 2012/12/01 (土) 18:39:32 - とりさん おおさん 抽象的な質問で大変申し訳ありません。 「さまざまな論文を見ますと、病気の部分は免染で発現が上昇した、という記述と、発現がなかったという記述と両方見られます」 →免染において、「病気の部分では核に局在のある細胞数が増加した、という記述と、逆に核に局在のある細胞数が減少した」という記述になります。 たんぱく質だけしか見ておらず、まだシグナル分析まで至っておりません。 今後行う必要があると思います。 「免疫染色でシグナルが病気で減ることは、発現を意味しなくても、病的状態を知る手がかりになりますし、それはそれでいみがあります。」ということには納得しました。 卒業が臨床系なので、基礎系の仕事はまだまだ勉強不足です。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1208-4 - 2012/12/01 (土) 18:28:31 - とりさん 早速のお返事ありがとうございます。 まっくろんさん 私はタンパク質の抽出には、病気の組織を4mm平方で切り取ってきて（核、細胞質、細胞外も入っています。）細かくして、SDSを用いた処理（熱処理100度２分）を行っています。 免染でたんぱく質Aが核、細胞質でのシグナルが消えても、細胞外にはたっぷりあることで、たんぱく質Aのm-RNAやタンパク質の発現が上昇したと考えると、不思議ではないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1208-3 - 2012/12/01 (土) 16:05:19 - おお >[Re:1] とりさんさんは書きました : > さまざまな論文を見ますと、病気の部分は免染で発現が上昇した、という記述と、発現がなかったという記述と両方見られます。 まず、事実関係を確実に言い表した方がいいです。最近の論文はそこを抜かしているものがおおいです。 >病気の部分は免染で、発現がなかったという 病気の部分は免染で、シグナルの消失が確認された。 シグナルの消失は発現が減少した事を意味していますでしょうか?そう考えると反対の結果が出る可能性もうなずけるのではないでしょうか。 組織、細胞内での振る舞い(どんな蛋白と結合してなど)や、蛋白の修飾の可能性、抗体がちがえばエピトープぶいもちがう、またテクニカルには固定方法の違いでも見え方がかわってくるでしょうし、そういうのを総合的に考えて判断するのがいいとおもいます。 ついでにいっておくと免疫染色でシグナルが病気で減ることは、発現を意味しなくても、病的状態を知る手がかりになりますし、それはそれでいみがあります。

(無題) 削除/引用 No.1208-2 - 2012/12/01 (土) 13:52:03 - まっくろん 　どのような因子か分かりませんが，方法で気になるところを。「病気の組織を採取して、タンパク質の発現〜」ですが，タンパク質の抽出はどのようにされていますか？細胞質などのタンパク質も合わせて（あるいはそれのみ）測定しているのであれば，ウエスタンで発現増強してもおかしくないような気はします。アポトーシスで良く検討されているCytochrome Cなど，ミトコンドリアと細胞質の両方を評価している報告もありますし（アポトーシスでミトコンドリアから漏出し細胞質で検出出来るようになると記憶しています）。可能であれば，細胞質，核内など分けてタンパク質を抽出し，検討してみてはどうでしょうか？

免染とたんぱく発現（western)の食い違いについて 削除/引用 No.1208-1 - 2012/12/01 (土) 13:15:28 - とりさん あるたんぱく質Aは健康な状態で、さまざまな細胞の核に局在しています。 病気になると細胞の核から細胞質を経由して、細胞外に放出されます。 免染で、健康な部分では核に染色されました。しかし、病気になった部分は染色されませんでした。 病気の組織を採取して、タンパク質の発現を見ましたら、westernでたんぱく質Aの発現上昇がみられました。m-RNAも同様です。 免疫染色では発現がみられないのに、westernでは上昇していることはあるのでしょうか。 さまざまな論文を見ますと、病気の部分は免染で発現が上昇した、という記述と、発現がなかったという記述と両方見られます。 病気の部分での免染の解釈についてどのように評価したらよいか悩んでいます。細胞の外に出たから見えなくなったのでしょうか。ネガティブコントロールと同じように、病気の部分はきれいに染色がないのです。 ご存じの方がいたらお教えくださると助かります。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---