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(無題) 削除/引用 No.12075-5 - 2024/01/12 (金) 00:24:25 - おお 経験は無いのだけど、思いつくことは糖質とか、死細胞から放出されたDNAとかでは無いかと。後者ならDNaseは有効でしょうけどそうで無い可能性もあるので、、、 > > 110cmdish ８０％コンフルに　FBS(-)Medium 5mLとサイトカインを添加 > 224時間後に上清を回収し、1000G 5min で死細胞などを除去 ちょと培養じょうせいはどうなるかという事もありますが、30000から100000gぐらいで遠心してもいいかもしれない。 > 34mL用アミコンに上清4mLをくわえ、4000G,20min,4℃で遠心し40uLほどに濃縮 濃縮の前に、300kDa cutoff でフィルターの素通りさせる。0.1や0.2umのフィルターでもいいかもしれないが、ちょっと心もとない。 > 4濃縮上清14uL, 4xsample buffer 5uL, 2-ME 1uLの合計20uLを95℃ 5min > 5SDS-PAGE > > となります。１０個の細胞株のうち、HT-29という細胞株だけ95℃5minのあとに粘性がでて、 サンプルバッファーで処理する前に、あらかじめサンプルに飽和尿素水を等量から1/2量加える。この場合サンプルは加温できない。 今手元にそのサンプルバッファーで処理したサンプルが残っているなら試しに飽和尿素水を加えてみてもいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.12075-4 - 2024/01/11 (木) 23:48:32 - たこ 仮にpHを上げて解決できるならTCAで濃縮してもいいのかもしれないですね。 HT-29だったか忘れてしまいましたが、いくつか大腸がん細胞株で培養上清のproteinを解析しているメンバーが過去にいましたが、彼・彼女も基本TCAで濃縮をかけていました。 場合によっては透析・凍結乾燥で濃縮していましたが、そのようなケースは聞いたことないです。 もし今使用されているHT-29特異的に起こる現象であれば解決にはならないですが・・・

(無題) 削除/引用 No.12075-3 - 2024/01/11 (木) 23:16:52 - vv 非専門家の思い付きですが、mucinならば、O-glycan glycosidaseの添加や、mucin自体が評価対象でないならばmucinaseを添加するのはどうでしょうか。 ピロリ菌はpHを上げることでmucinの粘度を下げて泳げるようにするそうなので、pHを上げるというのも手持ちの試薬で試してみてもいいかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.12075-2 - 2024/01/11 (木) 22:26:54 - ゆ mucinだと思う。粘液の素みたいなやつです。高分子量の糖たんぱく質で高濃度になると粘性が目立ってきます。消化管上皮系由来の細胞とかではたまにある。濃縮の邪魔だといって勝手に除去してしまっていいものかどうか。成分の生理活性に影響しないようなやり方の他の濃縮方法を検討してみたら。例；培養上清の場合、生理活性を温存できるマイルドな濃縮方法として硫安沈殿などがむかしからよく使われてます。

培養上清をアミコン濃縮してWBしたいが粘性がある場合 削除/引用 No.12075-1 - 2024/01/11 (木) 19:21:09 - 朝パン 種々の大腸癌細胞株にサイトカインを添加し、分泌タンパクをWBで評価しようとしています。プロトコルは 110cmdish ８０％コンフルに　FBS(-)Medium 5mLとサイトカインを添加 224時間後に上清を回収し、1000G 5min で死細胞などを除去 34mL用アミコンに上清4mLをくわえ、4000G,20min,4℃で遠心し40uLほどに濃縮 4濃縮上清14uL, 4xsample buffer 5uL, 2-ME 1uLの合計20uLを95℃ 5min 5SDS-PAGE となります。１０個の細胞株のうち、HT-29という細胞株だけ95℃5minのあとに粘性がでて、固まってしまいSDSPAGEができなくなります。アミコンで濃縮した際も色が２層に分かれていて 、何かSASPGEと相性の悪いタンパクを分泌しているのではないかと疑っています。 過去にはHEKにトランスフェクションした培養上清でも同じようなことがありました。 他の細胞株については問題なく行えています。 何か解決策がございましたらご教授していただけると大変助かります。 よろしくお願いいたします。

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