BioTechnicalフォーラム [ハイブリドーマが全滅]

(無題)

No.12055-19 - 2024/01/14 (日) 21:36:31 - TA

トピ主さん、その後、増えてきたハイブリドーマは問題ありませんでした？ところでそのハイブリドーマはIL-6なし培養条件で確かだったのですか？可能性として、凍結前はIL-６入り培地で、解凍後の培養がスパルタIL-6-free順化培養になっていた可能性もあるのかなと。

(無題)

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No.12055-17 - 2024/01/05 (金) 10:39:53 - toto

TAさん、詳しくありがとうございます。私が先にハイブリドーマ培地と書いてた中にBM Condimed H1というのが含まれていて、この中にIL6が入っていました。プロトコールの中身を知らずにやってたという・・　失礼しました。

(無題)

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No.12055-16 - 2024/01/04 (木) 21:20:36 - TA

>[Re:14] totoさんは書きました :
> TAさん、なるほど、IL6はSP2以外で必須になるのですね。SP2でやってるので知りませんでした。勉強になります。

もしかすると誤解があるかもしれませんので書き足します。
SP2/0にしろP3U1にしろ、B cellとfusionする前の単独培養時にはIL-6は必要ないという意味で書きました。Fusionした後の培養からIL-6を入れます。SP2/0に限らずIL-6を入れた方が出てくるコロニー数は通常激増します。ただし、同じSP2/0といっても出自により微妙にキャラクターが異なるようで、IL-6を入れなくても結構ハイブリドーマがとれるSP2/0もあるようです。IL-6を入れてのフュージョンはコロニーがたくさん取れるのは利点として、その後の培養にもIL-6を入れ続けるのは面倒です。そのため、確立後はゆっくりIL-6を抜く作業をしていきます。SP2/0由来ハイブリドーマは比較的早くIL-6なしメディウムに順化します。
ところで、totoさんはIL-6なしでハイブリドーマフュージョンをしているのですね？いいSP2/0を持っているということですね。

(無題)

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No.12055-15 - 2024/01/04 (木) 18:25:28 - おお

>[Re:7] ハイブリさんは書きました :
> おお様
>
> ありがとうございます。
> なるほど、TrypLEで細胞を剥がして、そこに同量のFBSを加え、終濃度10%になるようDMSOを加えて保存、ですね。確かに手間が省けていいですね。
>
DMSO は先にFBSと混ぜてます。有機溶媒が直接細胞に接触するのは良くないと思うので。ATCCは大抵の細胞で5%DMSOを推奨しているので、FBS+20％をTrypLE細胞濁度液と混ぜるには濃いすぎると思えるなら、DMSOの濃度は下げれると思います。

(無題)

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No.12055-12 - 2024/01/04 (木) 15:05:24 - ハイブリ

TA様

ありがとうございます。
Cellbanker 1 plusも買うことにします。情報提供いただき、大変助かります。
また、IL-6を入れることのメリットも理解することができました。
SP2には必要ないのですね。ありがとうございます。

(無題)

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No.12055-11 - 2024/01/04 (木) 15:04:13 - ハイブリ

mp様

ありがとうございます。
早速注文したいと思います。

toto様

今のハイブリドーマが増えてきて、期待とする抗体を作製していなかった場合、遺伝子のクローニングから、もしくは、抗体作りから始めることになりそうです。
その場合に、私自身もSP2やハイブリドーマをアクティブに扱うことになるため、ここで情報をいただけて大変ありがたいです。

(無題)

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No.12055-10 - 2024/01/04 (木) 13:54:15 - TA

まず凍結保存液ですが、特定の商品を薦めることには若干抵抗はありますが、私はCellbanker 1 plusを使用しています。念を押しておきますと、これでないとダメというわけではないです。

ハイブリドーマ作製時にはIL-6をいれるのが通常です。IL-6は昔はハイブリドーマ増殖因子とも呼ばれたりもしていました。mpさんのBricloneもIL-6 transfected cellの培養上清です。なお、SP2/0などのmyeloma細胞培養時にはIL-6はいりません。
ハイブリドーマ樹立後は、通常IL-6なしの培地に順化させます。ただし、別にIL-6を入れ続けていてもいいやという考えの人もいます。なので、保存ストックが樹立直後に保存されたものであれば、IL-6を抜く手順を入れてあるかどうか確認する必要があります。でも、少しは生きていて育ってきているのなら、大丈夫だと思います。

(無題)

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No.12055-9 - 2024/01/04 (木) 10:04:23 - toto

ハイブリドーマ作成はしてますが、研究の一環でやってるだけで、業務というほどではないので、TAさんのコメントを優先して下さい。私もIL-6ははじめて聞きました。もしかすると、それが凍結保存からの生存率に影響するのでしょうか。なお、１％くらいの生存率のときもありましたが、ほぼ回復できてました。同じ抗体を作る細胞が増えればいいので、とそのまま使ってます。

(無題)

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No.12055-8 - 2024/01/04 (木) 09:55:41 - mp

宣伝というわけではないですが、ハイブリドーマのクローニングの際、以下の試薬を使ったところうまくいきました。
ttps://www.saibou.jp/customer/pdf/catalog/briclone.pdf
残存細胞を増やす際に役立つかもしれません。

(無題)

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No.12055-7 - 2024/01/04 (木) 09:51:51 - ハイブリ

おお様

ありがとうございます。
なるほど、TrypLEで細胞を剥がして、そこに同量のFBSを加え、終濃度10%になるようDMSOを加えて保存、ですね。確かに手間が省けていいですね。

保存液の組成や保存の方法が全滅の原因でないとすると、トラブルシュートが難しくなってきました。

今日、ダメもとでfeeder cellsの上に細胞をまいてみようと思います。

(無題)

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No.12055-6 - 2024/01/04 (木) 09:47:50 - ハイブリ

TA様

まさか抗体作製を生業とされておられる方からコメントをいただけるとは思ってもみませんでした。
ありがとうございます。

市販の細胞凍結保存液をもし差し支えなければ教えていただくことは可能でしょうか？
また、IL-6を入れるというのは初めて知ったことでとても勉強になりました。

私の所属するラボでは、ハイブリドーマはとても貴重な細胞、との認識から液体窒素タンクの最下段に入れられていました。なので、窒素タンクが空になることが起こらない限り、細胞へのダメージは起こるかなぁ・・と思ってしまいます。といってもきちんとタンクがメンテナンスされてはいなさそうなので、空になったことがかつてあったのかもしれません。

あと、興味本位での質問なのですが、IL-6は融合前のSP0にも入れておくべきでしょうか？

(無題)

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No.12055-5 - 2024/01/04 (木) 09:41:38 - ハイブリ

toto様

保存液が問題ではなさそうで安心しました。
1%ほどは生きていそうなので、しばらく様子をみようと思います。

一点気になったのですが、ハイブリドーマの培地、ということですが、何か工夫をされていますでしょうか？
私の細胞はSP0という細胞を元に作出されたものですので、RPMI1640に10% FBSを加えたものを使用しています。IL-6などを加えるべきなのでしょうか？

(無題)

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No.12055-4 - 2024/01/04 (木) 02:30:31 - おお

>1. 90% FBS 10% DMSOは普通に使われる保存液の組成ではない
ハイブリドーマは使ってませんがうちは大抵それです。最近は接着細胞は手間を省略して血清、TrypLE１：１に１０％DMSOです。

>2. チューブをそのまま-80度に入れるのではなく、バイセルやらイソプロボックス内で緩やかに温度を下げるべきではないか

理想的にはそうですが（実際はもっと厳密に温度コントロールする装置もあるようですが）、色々な細胞株でー８０度にそのまま入れても保存できています。もう少し丁寧にやるならチューブをタオルペーパーなどでくるんでー８０度に入れるというのもありでしょう。常温でキープしてるCryoboxにいれてー８０度にいれてもBox内の外気の室温が急速に下がるのをある程度防いでくれる。

そういうことで上記のことで全滅はありえないような気がしてます。

チューブの数に余裕があるなら、１本は素早くRNA用のLysis bufferと混ぜてRNAを抽出してしまってもいいかもしれない。

(無題)

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No.12055-3 - 2024/01/03 (水) 14:44:32 - TA

職業的にハイブリドーマ作製をしている者です。市販の細胞凍結保存液の方がリカバリーがずっと良いのでそちらをお勧めしますが、だからといって90% FBS /10% DMSOでダメということはありません。また、ゆっくり凍結が基本ですが、これまたダイレクトに-80℃にいれたからといって全滅ということはないです。実際私も以前は10% DMSOメディウムを凍結液としてダイレクトに-80℃ボックスに入れていました（たくさん扱うときは手間削減を優先）。
従って手順外の何らかのトラブル／不手際があったのではないでしょうか。
例えば誰かがタンク内の細胞を探すのに手間取りラックを長時間室温に置いたままにしていたとか。解凍直後にすでに死んでいるのか、解凍後徐々に死んでいくのか、どうでしょうか？もう一つ、培養条件。ハイブリドーマを作製するときにIL-6を入れることが多いですが、その後IL-6 freeメディウムに順化されていないのに（あるいは順化したつもりでいて、単に微量の残量IL-6で増殖していたところで）凍結して、解凍後IL-6 freeメディウムで培養してしまった、とか。

(無題)

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No.12055-2 - 2024/01/03 (水) 12:17:30 - toto

ハイブリドーマでも普通の培養細胞と保存法は同じにしてます。培地はもちろんハイブリドーマ用ですが。90%FBSでも、そのほうが良いかはわかりませんが、少なくともそれでダメになることはないです。私もそれで保存してみたこともあります。
確かに凍結速度が早すぎた可能性はありますが、その方の記録で、tubeを-80度に入れたとのことで、それはたとえば発泡スチロールの箱、或いは紙箱でもなにかそういう入れ物にいれてある程度凍結を遅らせた、という意味ではないのですね？発泡スチロールの箱の中に紙箱を入れるであればむしろ生存率がバイセルやイソプロ保存容器よりも良かったりします。なお、培養細胞によってはそのまま裸でー80℃に入れても十分高い生存率だったりもしますが。
ハイブリドーマは最善の条件でも生存率は高くないですが、ダメかなと思ってもしばらくほっておくと、生えてくることも割とあります。細胞がなるべく良い状態の時に保存するように気をつけてますが、どの細胞でもそうですね。

ハイブリドーマが全滅

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No.12055-1 - 2024/01/03 (水) 11:17:45 - ハイブリ

いつも勉強させてもらっています。

昔の先輩が作製されたハイブリドーマを液体窒素タンクから起こしたのですが、ほぼ全滅しているようです。
今後抗体遺伝子をクローニングして組換えタンパク質調製をすることになりそうですが、その前にお聞きしたいことがあります。

ハイブリドーマの保存の方法についてです。
ラボノートをみると対数増殖期に保存したとありました。
具体的には、前日に培地交換、当日に遠心して上清を除いたのち、90% FBS 10% DMSOで懸濁、それをcryotubeに入れ、そのチューブのまま-80度に一晩、さらに次の日に液体窒素に入れたとあります。

気になる点は２つあり、
1. 90% FBS 10% DMSOは普通に使われる保存液の組成ではない
2. チューブをそのまま-80度に入れるのではなく、バイセルやらイソプロボックス内で緩やかに温度を下げるべきではないか

です。
遺伝子クローニングは予定になかったことなのでうまくいくか自信がありませんので、どうにか残存細胞を増やしたいです。増やす際のコツ、チップスなども併せてご教示いただけますと大変助かります。
どうぞよろしくお願いいたhします。

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