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(無題) 削除/引用 No.12054-5 - 2024/01/04 (木) 02:52:23 - TY み様 ご教示いただきありがとうございました。 確かに複数抗体で確認してみた方が安心ですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12054-4 - 2024/01/03 (水) 13:54:59 - み 抗体の特異性を確認されたとのことですがどれだけ信用できる方法なのか。 内在蛋白が本当に検出されているバンドなのか？ 外来性は認識するが内在は検出限界以下の抗体なんて幾らでもある。 複数の抗体で検証するなり外来強制発現をsiRNAで抑制するなど蛋白のターンオーバーを検討するのも必要かも。

(無題) 削除/引用 No.12054-3 - 2024/01/03 (水) 00:42:03 - TY おお様、 丁寧に教えていただきありがとうございます。 毎回ネガティブコントロールのsiRNAを導入し、コントロール細胞として比較対象にするようにしていたのでオフターゲットの可能性は低いかなと考えておりましたが、確かにもう一種類新たにデザインしたものを試しておいた方が良い気がします。ありがとうございます。 20nM, 50nM, 100nMでsiRNAを導入しqPCRで確認した際はどの濃度でもおよそ80%減くらいの減少を示しており、タンパク質レベルも少しくらい落ちていていいのではないかと思ったのですが、全くと言っていいほどバンドに差が見えませんでした。今までsiRNA実験は幾度となく行ってきたのですがこのようなケースは初めてで戸惑っています。 ご教示いただいた通りアイソフォームの確認も行ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.12054-2 - 2024/01/02 (火) 23:25:37 - おお 想像で書きますが、微妙な発現制御の抑制で、十分効果がみれているにかもしれません。何らかの生理的状態(現象)の時に(例えばセルサイクルの特定のフェーズとか)、発現が上がるのが必要だったりするけど、細胞集団がヘテロ(細胞周期にしても色々なフェーズが混在するとか)であって十分な抑制効果が全体としても見にくいのかも知れません。過剰発現の場合でも、エンドの10％ぐらいの発現でも何らかの効果がみれる場合もありますし、それをタグでなくエンドの抗体で検出しても差があるように見えない。 それで、発現の減少を確認するためという事については、そのタンパク質の半減期が長いこともありますので、導入後、72時間後とか長めに時間をとる。場合によっては４８時間後にもう一度導入して９６時間後に見る(増殖などによって細胞あたりのsi RNA が減るので)と言うやり方もアリかと思います。増殖が速くてふえすぎるなら、二回目の導入前に継代すると言うのも見られます。 導入効率については、他のsiRNA でその条件で大丈夫なら恐らく大丈夫だと思います。ただ直接的ではないので少し説得力がないと言えば反論しにくいと思いますが、例えば昔使った抑制効果ががみられるsiRNA と混ぜて導入するwell を並行して用意しておけば、自分が納得する材料にはなる。これを応用して、GFPなどを発現した細胞株があるならGFPに対するsiRNAを混ぜておけば効率はモニター出来る。 > 実はどちらのノックダウン細胞も狙った表現型を呈した上 コントロールで表現系がみられないならまずはKDによるものと言っていいと思いますが、オフターゲットの指摘をされるかもしれませんので、もう一種類デザインしてみてもいいのかもしれません。 念のため、siRNA とPCRで検出されないアイソフォームを確認してみた方が良さそうです、多分大丈夫と思いますが。

siRNAノックダウン効率の測定 削除/引用 No.12054-1 - 2024/01/02 (火) 19:30:43 - TY siRNAのノックダウン効率測定について教えてください。 これまでずっとトランスフェクション48時間後にWestern Blotでタンパク質発現量が低下していることを確認してきたのですが、先日新しく使用したsiRNA(20nM)でタンパク質量の発現抑制が全く見られませんでした。100nMまで濃度を振ってみましたがいずれも結果は同じでした。 今回siRNAを二種類同時に購入し試したのですが（ターゲットはそれぞれ異なる遺伝子です）、どちらもタンパク質量の変化がありませんでした.ところが実はどちらのノックダウン細胞も狙った表現型を呈した上に、qPCRでmRNA発現量を確認したところ20nMの濃度でも十分発現が抑制されていました。 Western Blotでタンパク質発現低下が確認できないことにはどのような要因が考えられるでしょうか。 抗体自体がワークすることは事前に確認済みです。 何かご存知の方がいらっしゃいましたらご教示いただけますと幸いです。宜しくお願いします。

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