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(無題) 削除/引用 No.12046-3 - 2023/12/27 (水) 14:24:08 - あの 通常はWBを使うと思うのですが、どうしてもEIAで調べたいならば、 RIPAバッファー（あるいはNP40）のEIAの濃度スタンダードにも、最終濃度が同程度になるRIPAバッファー（あるいはNP40）を入れてみて、きちんとスタンダードカーブを描けるか調べてみることをおすすめします。 それから調整したサンプルを、アッセイバッファで2倍希釈、4倍希釈、、、32倍希釈などしてみて、上記のスタンダードカーブとパラレルになるかどうかを調べてみることをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.12046-2 - 2023/12/27 (水) 08:08:33 - おお 使っている抗体やタンパクによるので答えにくいです。RIPA Buffer中で反応しない抗体もあります。Lysateから５ul取ってアッセイの反応溶液で希釈するとかだとそういう場合もベターな結果になるかもしれませんがうまくいくのか確認しないと結論が出ないでしょうし、量によっては希釈できないかもしれない。反応したとしても検量線で同じバッファー組成にしてないとブレることもあると思います。 NP-40のほうがマイルドで使いやすいと思いますがRIPAと同様の配慮はした方がいい。 また、そのタンパクがNP-40で十分抽出されるのか、それより強いRIPAのほうが抽出効率が格段に上がるのかなども考えて見る必要があるように思えます。 ただし、分泌タンパクということなので、ERなどを経て分泌されるものなら（たまに例外的挙動を示すタンパクもあるみたい）、NP-40で膜を溶かせば十分溶出してきそうなきはします。

RIPA lysate ELISA 削除/引用 No.12046-1 - 2023/12/27 (水) 03:17:27 - ぶん とある分泌たんぱく質を一過性に過剰発現させて細胞から培養上清へのたんぱく質分泌と細胞内での発現を確認しようとしています。対象のたんぱく質はELISAの測定系が充実しており当方も測定の経験があります。お伺いしたいのは、細胞内でのたんぱく質を発現を確認するときに、上清を回収した後の細胞をPBSで洗浄しRIPAで調製した溶解液をELISAに使えるのかな？という点です。ThermoのウェブサイトだとRIPAはELISAも対応しているということですが、本当にRIPAでELISAがいけるものなのか、可溶化するならNP40のほうがよい、など経験談がありましたらお寄せいただけると助かります。

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