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(無題) 削除/引用 No.12045-14 - 2024/01/05 (金) 01:00:14 - SYBR master >[Re:1] ゲノムPCRさんは書きました : > 約1.7 kbほどクローニングしたい領域があり、マウスtailから自前で抽出したゲノムからKOD-Fx-NeoやPrime Star MAXを用いてPCRを試みていますが、スメアになってしまい、シングルバンドを出せれていません。 ここまででは出ていない情報なので、あえて書きますね。 PCRでは、実は増えない配列って物がこの世には結構多数存在します。知っている範囲では「CAG promoter」は有名(だと思う）なのですが、これを知らないと「たかだか増やす」だけで無駄に時間消費します(同期はこれだけで6っか月以上無駄にした）。増えないDNA配列はPCRでは増えないんです。「CAG promoter」は局所的なGC_richで増えない（論文有ったと思う）が、他にもAT_richでも増えません(論文有)し、また「G_rich」だけでも増えません(論文有）し、配列が高温でも2次構造を取る物は増えません(これも論文有）。また、正確に増えないという意味では、7個以上のpoly(N)すなわちcDNAのpoly(A) tailも上手く増えません(これに関しては論文の有無は覚えていないけど、確か東洋紡のKOD開発関連で報告有った)。 また、今うちの院生が発見した例では、一見なんの問題も無い配列だけど、PCRやると必ず4 baseの欠損が起きる配列も存在するようで、理由がわからずPCR不可の配列は多数あるのかもしれません(上手くいかない配列だと、そもそも論文にすら成らないので)。 で、ここからが重要な情報になると思うのですが、「PCRで増えない」配列は、基本的に「人工合成不可」な配列です。「合成可能」はPCRが可能な配列を前提に作成されています。なぜなら「合成可能」な配列はPCRをベースとしたPCA(polymerase cycling assembly)と言う技術で作られているため、PCR不可なら基本的には「人工合成」できません。なので、PCR可能な配列への変更を求められる(一部の塩基を置換して良いかとか、聞かれます)か、基本的に合成の拒否(そもそも無理なので)が行われます(これ、メーカーのHP見ると書いてあるんですよね）。

(無題) 削除/引用 No.12045-13 - 2023/12/27 (水) 11:32:51 - AA 遺伝子改変動物作成などの都合で2-3kbp程度のゲノム領域をよくPCRで増やします。2-3mm程度のtail組織片をProteinaseK消化/フェノールクロロホルム処理/イソプロ・エタノール沈殿で回収してgenomic DNAにしています。 サザンをやる人からは、ボルテックスなどとにかくせん断が起きうる操作は全部駄目！、と言われることもありますが、そこまで気にしてはいません。 そのせいかどうかはわかりませんが、どうしても増えにくい領域というのはたしかにあります。 その場合は大抵はプライマーをどんどん変えて解決することが多いです。1.7kbpで増えないなら2kbにして試す、という感じです。酵素を変えて解決することもあります。(個人的には最近の酵素だとTakaraのTks GflexがPrimaestar系よりも優秀でお気に入りです。) 例えばよく使われているBAC-Tgマウスなどを作成したBAC使えるならそこから取ってくるというのは自前でクローニングするよりも論理としては良いかもしれません。 ただ、BACにしか乗らないほど長大な領域をプラスミドにのせるのは不可能なので、結局部分的にしか使えないのであればBACに拘る理由はないのかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.12045-12 - 2023/12/27 (水) 11:26:23 - おお 他にできることは、1.7 kbの真ん中辺にプライマーを設定してオーバーラップした２つのPCR産物つくり、それをオーバーラップPCRなどの手法で1.7 kb全長をえる。または制限酵素処理サイトがあるならそこがオーバーラップするようにプライマーを作り、その制限酵素で切って、３ピースLigationするとか、単に制限酵素処理後の２つの断片をLigationしたあと全長PCRするとか。 PCRでつかうゲノムの量はなるべく抑えたほうがいい。数十ナノグラムあれば十分。 たまにあるんだけどPCR後電気泳動したら使ったゲノムもエチブロとかで検出されてしまうとかとんでもない量入れてしまう人がいる。

(無題) 削除/引用 No.12045-11 - 2023/12/27 (水) 10:54:05 - ねずみ DNAの抽出はどのように行いましたか？ アルカリーボイルー中和であれば、他の方も仰っているように1 kb以上の長さの増幅には不向きです。KOD Fxで3 kb程度まで増やせる場合もありますが、効率は悪いです。 尻尾でも耳のかけらでも、通常通りProKーフェノクローエタ沈で精製すればlong PCRに使える程度のDNAは抽出できます。 あとは、設計したプライマーがrepetitive seq.にかかっていたりしませんか？

(無題) 削除/引用 No.12045-10 - 2023/12/27 (水) 09:57:33 - G25 BACクローンから当該領域をPCRするというつもりでなく、 ベクターを使った古典的な方法でsubcloneしようというなら BACを出発材料にしたいというのは理解できます。 そんな面倒くさいことしようとは思っていないでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.12045-9 - 2023/12/27 (水) 09:39:05 - G25 たぶんDNAのクオリティが悪いだけなので、ちゃんと精製したらいける。 Tailなんて精製が困難な材料じゃなくて（あえてtailみたいなDNA精製しにくい材料を使うのは動物を生かしたままgenotypingするためでしかない）、sacrificeしたマウスがあれば肝臓とか精巣とか組織を頂いてもいいでしょうし、採血を使ってもいいでしょう。たかが1.7 kbくらいなら少量の血液をChelex-100（instagene）で処理したものでもいけそう。 ちょっと気持ち悪いけど、3T3のようなマウス由来の細胞株でもいいかも。 BACを買うのも結構だけど、あえてBACに拘泥する必要はないのでは。 BACなんかは公的なバンクとかゲノムプロジェクトのコレクションが元になっていて（distributionは業者が受け持っていたりはするけど）、MTAとか煩わしい手続きがあったりする。 市販品で済ますなら、精製済みのゲノムDNAだって各社からでてる。 https://www.promega.jp/products/biochemicals-and-labware/nucleic-acids/mouse-genomic-dna/?catNum=G3091 コストだってBACと大差ないだろうし、お金だけの関係で権利関係などの煩わしさがない。 ゲノムDNAを精製したい->ならtail DNAしかない 既製品を使おう->ならBACだ と考えが固まっちまうのは柔軟性が足りないような気がするが、いかが。

(無題) 削除/引用 No.12045-8 - 2023/12/27 (水) 06:34:27 - おお 先ずtail からのDNA抽出方法はジェノタイピングで使われるものだと2、3百ベースのアンプリコンがかかれば良いのでクルード(短いのでそれでもかかりやすい)で、断片化が進む可能性があるものでも許容されます。高分子のものを慎重にとるほどでは無いにしろ、少し考えた方がいいです。 ジェノタイピングでもDNAが溶けていればいい程度の方法がありますが、それでは上手くかからず精製度を上げたりする事もあります。長くなれば尚更です。クロロフォルムで2回ぐらい処理してエタチンすれば相当綺麗になることが大抵ですが、クロロホルムが使えないなら、飽和尿素水を用意して1:1で混合した後エタチンしてもいいでしょう。 タッチダウンはググってみてください。結構有用です。アニーリング温度を探る必要もなくなります。あと指摘があるnestedもやる価値があると思います。 で、その1.7kbの中にない制限酵素で完全消化し、アガロース電気泳動で分離し、1.7kbの配列が含まる所前後を切り取りゲルから抽出すれば純化が進むのでPCRがかかりやすくなります。 BACはググれば何かはわかるでしょう。ゲノム断片のライブラリーからクローンを拾った物ならファージもあり得ると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.12045-7 - 2023/12/27 (水) 06:17:06 - PCR PCRを、通常の（95C、58C（位。アニーリング温度）、72C）の3ステップを繰り返すサイクルで行わず、（95C30秒、68C5（又は10）分）x35で行う。昔ノーベル賞学者に教えて貰った。なぜか上手くいくことが多く（が、理由をきちんと正確には説明できない）、友人知人にもこれを勧めたところ、騙されたと思ってやってみたら本当に上手くいった、という結果になったこと数回。 1. これでも上手くいかないことが1、2度はあったが、それでも自分の経験では成功率は9割5分はある 2. アニーリングかつ伸長ステップの68Cの時間は、産物の長さに合わせて短くしても上手くいく（ことが多い）。自分だったら1.7kbpは2分でやると思う 3.proof readingの良い酵素（私はNEBのQ5を使ってたが、最近はもっと安くて良い酵素ありますかね？）を使う場合でもこれで上手くいった

(無題) 削除/引用 No.12045-6 - 2023/12/26 (火) 23:31:50 - 774R nested PCR

(無題) 削除/引用 No.12045-5 - 2023/12/26 (火) 23:21:49 - おお 精製度 タッチダウン

(無題) 削除/引用 No.12045-4 - 2023/12/26 (火) 21:20:16 - が BACならBRC. ペイすればDNA精製のオプションもある。

(無題) 削除/引用 No.12045-3 - 2023/12/26 (火) 21:16:34 - が 1.7kb だとIDTのgBlock HiFiをオーダーする、今なら年末キャンペーンやってるんで、25%OFF, 3-4万で合成してくれるよ。

(無題) 削除/引用 No.12045-2 - 2023/12/26 (火) 20:52:14 - ゲノムPCR そこでどうにかそれを入手したいのですが、RIKEN BRC遺伝子材料開発室から入手するのが第一選択でしょうか？ 昔学部生だったころ、先輩がthermoかinvitrogenからBACかなにかを入手していたと思います。 ですがうろ覚えです。 どうかお助けいただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。 ちなみに、BRCから購入した場合、大腸菌が送られてくるようです。 よくBACをわかっていませんが、プラスミドのようなもので、その巨大バージョンということでしょうか？

ゲノムPCRがかからない。クローン？BAC? 削除/引用 No.12045-1 - 2023/12/26 (火) 20:47:32 - ゲノムPCR とても恥ずかしい質問なのですが、ご教授いただけましたら幸いです。 私は今、マウスゲノムから、ある遺伝子の転写制御領域をクローニングすることで、遺伝子発現のレポータープラスミドを作製したいと思っています。 約1.7 kbほどクローニングしたい領域があり、マウスtailから自前で抽出したゲノムからKOD-Fx-NeoやPrime Star MAXを用いてPCRを試みていますが、スメアになってしまい、シングルバンドを出せれていません。 プライマーはfwdを3つ、revを３つ注文しまして、3x3の9通りのプライマーペアで行っていますが、いずれもスメアでした。annealing tempも検討しましたが改善せずでした。 そこでファスマックによる人工遺伝子合成を考えたところ10万円近くするとのことで難しいです。 そこで、当該領域を含む場所のクローンというものがNPOから売られているのでは？と知り合いからコメントいただきました。

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