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(無題) 削除/引用 No.12023-9 - 2023/12/22 (金) 04:31:14 - おお ちなみに少量の２つのDNA断片とプライマーを入れてPCRすると、両者が繋がってないDNA断片の一本鎖が最初はドミナントになるだろうから、オーバーラップしたところのアニーリングがより確実になる可能性があります。 この効果を最大限に利用するなら、それぞれの片側断片とそれにアニーリングするプライマーだけでPCR反応（実際はPCRとは言えない）をして一本鎖を合成して、その後で両者をMixするというやり方も考えられる。 もちろんいつも理論通りになると言えないけど。

(無題) 削除/引用 No.12023-8 - 2023/12/20 (水) 14:57:23 - 774 解決？したようなので必要ないかもしれませんが。 >>そのままPrimerを加えて３０サイクルですが、それでほとんど問題ありません。 >Primerなしの反応液にそのままPrimerを加えるということでしょうか。 >(Primerなしの反応液をけtemplateとして新しいPCR反応液を作るのではなく、) そうです。５サイクル終わった時点でpauseで止めて、primerを添加して再スタートしてます。 おおさんのアドバイスのように、最初からprimerを加えたPCRで問題なければそっちの方が楽です。

(無題) 削除/引用 No.12023-7 - 2023/12/20 (水) 13:55:49 - aa えー 結論から申しますと、小さいバンドはたまたま元の断片のサイズだっただけで、実際はノンスペだった可能性が濃厚でした。 150+150で300にする実験だったのですが、150のバンドができていた、というのがこのスレを立てた動機なのですが、 先ほど500+500で1000にする実験の結果がでました。 今回は500 ntの位置にバンドはでず、ノンスペとして150の位置にバンドが出てしまっていました。 実験条件がおかしかったというよりかは 最初のPCRのノンスペがたまたま元の断片の長さだったので考察を間違えてしまっていたと思います。 お騒がせしました。 いただいたアドバイスは今後のために勉強させていただきました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.12023-6 - 2023/12/20 (水) 12:26:10 - aa おお様 ありがとうございます。 確かに、元のがそのまま残ってバンドに出ているのはおかしいですね。 チェックしてみます。

(無題) 削除/引用 No.12023-5 - 2023/12/20 (水) 12:22:36 - おお 0.15 pmol/50 ulということはたとえば５００bpで１ng/ulぐらいですよね。 最初のプライマーなしPCR反応溶液から１ul 取ったわけだから１ng/ulを更に希釈して一部取ったわけだから大元の残りがしっかり検出されるほどあると思えないのだが。インプットの量間違えてないかなとおもう。もしそうでなければノンスペでPCRの条件があまり良くないかもしれない。 お示しの量よりもさらに５０分の１ぐらいに減らして、プライマーを最初から入れた状態でPCRをしてもいい。

(無題) 削除/引用 No.12023-4 - 2023/12/20 (水) 12:09:00 - aa 一つ前のレスはハンドルネームを間違えました、

(無題) 削除/引用 No.12023-3 - 2023/12/20 (水) 12:07:46 - nan 774様 ありがとうございます。 DNA断片はゲル精製しています。 >そのままPrimerを加えて３０サイクルですが、それでほとんど問題ありません。 Primerなしの反応液にそのままPrimerを加えるということでしょうか。 (Primerなしの反応液をけtemplateとして新しいPCR反応液を作るのではなく、)

(無題) 削除/引用 No.12023-2 - 2023/12/20 (水) 10:57:41 - 774 ２つのDNA断片は精製済みとのことですが、ゲル精製でしょうか？カラム精製のみでしたらゲル精製を行うことをお勧めします。 同じような実験を行う際にPCRに持ち込むDNA断片の濃度測定はしておりませんが、電気泳動でギリギリ見えないくらい量を入れてます。Primerを加える前の増幅はアニーリングを低めに設定して５サイクルで行って、そのままPrimerを加えて３０サイクルですが、それでほとんど問題ありません。Primer添加前のゲル精製は量的に無理じゃないですかね？ 重なりも18ntとのことで十分だとは思いますが、どうしてもダメなら増やしてみるのも手かもしれませんね。 それかどこかに重なり部分のPrimerがコンタミしてるか。

overlapping PCR 削除/引用 No.12023-1 - 2023/12/20 (水) 09:39:40 - aa overlapping PCRで元となる２つのDNA断片のくっつき具合が悪くて困っています。 重なる部分は18 ntで、CG含有率=55.5、Tm値=61.9です。 精製済みの２つのDNA断片をそれぞれFinal 0.15 pmol/50 ul (PCR反応液)になるように添加し、プライマーなしで15 cycleのPCRをかけます。 その後、そのPCR産物1 ulをtemplateにしてプライマーあり(一方のFowardともう片方のReverseを用いて全長を挟み込むように)で30 cycleのPCRをかけます。 プライマーなしPCR後、プライマーありのtemplateとして添加する前にはゲル精製はしていません。 プライマーあり後に電気泳動すると、大元のDNA断片と思しき長さのバンドが強く出てしまいます。overlappingしている長さのバンドも出ているのですが、大元の断片よりも薄いです。 [overlapping成功]/[大元の残り]のバンド強度の比率が1/3くらいです。 この状況に困っています。 (それとも[overlapping成功]/[大元の残り]の比率はこんなもんなのでしょうか。purification PCR (プライマーあり)で30 cycleもかけているのでそんなはずはないですよね。。。) プライマーなしのPCR時にきちんとoverlappingしていないことが原因だと考えています。 検討箇所としては 1. 重なる部分の再設計 2. プライマーなしのPCRのアニーリング温度 3. プライマーなしのPCR後に一旦ゲル精製をする だと思うのですが、他に検討すべき箇所がありますでしょうか。 また、1, 2, 3に関してもアドバイスいただければ幸いと存じます。 例えば、2は下げた方がいいのでしょうか？ 3はそもそも可能なのでしょうか。(プライマーなしのPCR後はDNAが薄くてゲル精製不可？) ご経験ありましたらアドバイスいただけますと幸いと存じます。 よろしくお願いします。

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