BioTechnicalフォーラム [マウス脳の灌流固定について]

マウス脳の灌流固定について

No.12007-TOPIC - 2023/12/13 (水) 22:28:12 - io

類似したトピックがあるかもしれませんがご容赦ください。

免疫組織化学染色するために凍結標本を作製しているのですが、
Cryostatでセクショニング段階で脳の部分がグチャっとしてしまいます。

様々なサイトでCryostatのコンディションについて書かれておりました。
もちろんCryostatの温度や設置場所の気温による影響も存じており、何度も調整をしました。
しかしそれでもうまくセクショニングできませんでした。

以前うまくいった標本とうまくいかない標本を比べてみましたところ、後者の方が脳の部分が柔らかいような気がしました。
この差は灌流固定がうまくいっていないからだと現在考えておりますがどうでしょうか。

ちなみに灌流固定は他の方もやっているような左心に生食と4%PFAをシリンジで灌流する方法をしております。

駄文で申し訳ございません。
　

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(無題)

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No.12007-8 - 2023/12/17 (日) 19:53:37 - み

庫内温度が気になります。
マイナス18から21度くらいで異常のない機器、手技なら大丈夫だと思います。
還流固定せず生の脳を無固定でOCT包埋してやっても駄目ですか？
肝臓など他の臓器と遜色ない手技でいけます。
ぐちゃっとなるのが温度の問題なのか切る速度の問題なのか。
自分はゆっくり刃を下ろします。

(無題)

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No.12007-7 - 2023/12/15 (金) 11:08:08 - SN

包埋サンプルを作製する過程は大丈夫そうですね。
ぐちゃっとなっているのが、丸まってしまって綺麗にスライドグラスに貼り付けられないのであれば、あのさんも推奨されているように少し厚めの切片で（見たいものと顕微鏡のスペックにもよりますが…）、フリーフローティングで染色するのが簡単だと思います。
脳が溶けるように崩れてしまっているなら、きちんとクライオスタットの冷却が必要だと思います。庫内の温度が表示されている温度になっているか確認してみても良いかもしれません。

(無題)

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No.12007-6 - 2023/12/15 (金) 06:27:55 - あの

マウス脳を扱ったことはなくて他種の脳での経験ですが次を検討することをおすすめします

　切片厚　50マイクロぐらいの厚切り
　サンプルにpath freezerをスプレーする
　刃は　ハイプロファイル
　アンチロールを使わないで、すぐに濡れた絵筆で、PBS入りマイクロプレートにとる
　染色はフローティング法
　クリオスタットは前述から冷却
　部屋の室温に注意　冬場は暖房を切る
　ドアを開けている時間を短くする

固定などのサンプル調整段階には問題なさそうなので、クリオスタット段階に問題ありそうな気がします。

>(無題)様

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No.12007-5 - 2023/12/15 (金) 02:50:00 - io

返信ありがとうございます。

ご指摘のとおり包埋した脳は-80度のdeep freezerに保存して数日経ってからセクショニングするようにしております。

(無題)

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No.12007-4 - 2023/12/14 (木) 23:02:25 - SN

ドライアイスで包埋した脳は、そのあとすぐに切っているんですか？それとも一度、－80度で保存してから使っていますか？

>(無題)様

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No.12007-3 - 2023/12/14 (木) 16:19:01 - io

返信ありがとうございます。

ご指摘の件ですが、灌流固定の後しばらくPFAで後固定し、その後30%スクロースでCryoprotectionしてからドライアイスパウダーで包埋しております。