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(無題) 削除/引用 No.12004-13 - 2023/12/22 (金) 20:41:13 - dsRNA ヌクレアーぜフリーのBSAはあるので是非試してみます。

(無題) 削除/引用 No.12004-12 - 2023/12/22 (金) 03:18:57 - おお >[Re:10] G25さんは書きました : > > あと、ブロッキングのスキムミルクですが、品質はピンキリでしょう。 > RNaseの夾雑など大丈夫でしょうか。 > NorthernやってったときはBoehringer/RocheのBlocking reagent（高度に精製されたミルクカゼイン）のストック溶液をDEPC処理したものを使っていました。 そこは気になっていたところですが、書くときにもらしてしまいました。検出の過程はRNAse freeにこだわる必要があると思います。ミルクの代わりにNuclease-FreeのBSA にするとか。Ribonucleoside Vanadyl Complexは効くかな？

(無題) 削除/引用 No.12004-11 - 2023/12/21 (木) 22:18:38 - dsRNA >おお様 各ステップが確実かどうか、調べてみます。蛍光二次抗体を使っているのですが、他のウェスタンでワークしています。 >G25様 UV架橋あり、なしの両方で試してみます。標準のプロトコルはニトロセルロースとHybondN+の2種類があったのですが、どちらもだめでした。 ブロッキング剤ですが、dsRNAなのでRNaseAでは分解されないのではないでしょうか。 以前にm6Aを抗体で検出しようとした時も同様のトラブルに見舞われたので、なにか根本的なミスをしているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.12004-10 - 2023/12/21 (木) 14:28:11 - G25 UVクロスリンクは非破壊的とは言えない方法なので、第一に疑われます。 UVによるRNAの分解、架橋、二重鎖の解離などが起こって抗原性を失っていないか。 ポジティブチャージのナイロンなら、ブロット後にair-dryするだけでもかなり強固に固定されます。ハイブリダイゼーションのように長時間、比較的高温で界面活性剤たっぷりのバッファー中にさらされるのとは違うのだから、クロスリンクなしでも十分保持されるかも。いちど試してみては。 UVを使用するにしても、予め最適条件を調べてからにするとか。 Northernをやってたころ、メンブレンのブランドを変えたときなんかには、 一枚のメンブレンストリップにRNAのドットブロットをレプリケートして、UV照射時間を振って良さそうな照射量を決めてました。 あと、ブロッキングのスキムミルクですが、品質はピンキリでしょう。 RNaseの夾雑など大丈夫でしょうか。 NorthernやってったときはBoehringer/RocheのBlocking reagent（高度に精製されたミルクカゼイン）のストック溶液をDEPC処理したものを使っていました。

(無題) 削除/引用 No.12004-8 - 2023/12/21 (木) 08:45:46 - おお こういうのは一つづつ潰していくのが大抵のやり方です。 ちゃんとRNAは膜に吸着しているのか（メチレンブルーで染めてみてもいいかも）？ UVクロスリンクがどの程度影響しているのか？ 抗dsRNA抗体は免疫染色でワークしているという判断なので（その判断がいいか悪いかこちらからわからないけど）いいとして、 ２次抗体はワークしているのか（HRPとか４度では数ヶ月で駄目になるし、これはバックグランドが全く出ないようならありえる）？ 検出キッと（ECL？）はワークしているのか、検出感度が十分なものを使っているか。 UVクロスリンクについてはPMID: 36853733では標準では使わず乾かしている（オプションとしてUVクロスリンクを紹介してる）。 その他抗dsRNA抗体の抗体濃度、処理時間、Washの仕方なども視野に入れてもいいかもしれない（そういう点で扱いにくい抗体が稀にあるので）。

(無題) 削除/引用 No.12004-7 - 2023/12/21 (木) 03:09:40 - dsRNA その後、ugからngまで希釈系列を作ってpoly(I:C)をドツトブロットしたのですが、シグナルが全く見えませんでした。抗体及びブロッキングバッファーはプロトコルとして報告されているものと同じものを使いました。 substrate RNAがメンブレン上にあると思われるのに検出できないことについて、アイデアがありましたら教えていただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.12004-6 - 2023/12/13 (水) 19:57:13 - dsRNA G25様、 poly(I:C)を買ってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.12004-5 - 2023/12/13 (水) 09:56:10 - G25 ポジコン用のdsRNAが売られているくらいですから、 まずポジコンを検出するところからやってみては。 https://www.funakoshi.co.jp/contents/67422 さすがにポジコンだけのためにこの製品は高すぎますけど。 poly(I:C)なら安価に入手できる製品もあるかもしれない。 https://www.exalpha.com/products/double-stranded-rna-control-polyic/10090100 poly(I:C)はMabのクローンによって親和性に差異があるらしいけど。 将来的に検出ができるようになってからもpositiveとpseudopositiveの見分けにリファレンスとなるポジコン用の標品があって損はない。

(無題) 削除/引用 No.12004-4 - 2023/12/13 (水) 02:23:58 - おお >[Re:3] dsRNAさんは書きました : > おお様、 > ご教示ありがとうございます。プロトコル通りやってみたのですが、なぜうまくいかないのか不思議です。 気をつける点、操作しながら確認できる点を抑えていないと手順だけでは伝わらない要領をのがしてしまうことがあります。

(無題) 削除/引用 No.12004-3 - 2023/12/13 (水) 00:04:20 - dsRNA おお様、 ご教示ありがとうございます。プロトコル通りやってみたのですが、なぜうまくいかないのか不思議です。

(無題) 削除/引用 No.12004-2 - 2023/12/12 (火) 07:05:54 - おお この手の実験はステップが多いので、確実なポジティブコントロールを置くことをおすすめします（要するに各ステップそれぞれがワークしているかを見る必要がある）、例えば、 dsRNAマーカー https://www.funakoshi.co.jp/contents/899 自作In vitro transcriptionでセンス、アンチセンスを合成して作る。 例えばDrosophila S2細胞でウイルスなどの感染がないような場合、２ug程度で以下の論文でうっすら見えている程度。それくらいの感度がなければ難しいかもしれません。また同論文では電気泳動後Transferしているデーターも示しているが、こちらのほうがいくらか感度がいいようにも見える。細胞内で均一の長さのdsRNAができているのなら、一度やってみてもいいのかもしれない。分解していたらスメアーになったりもするので精製がうまく行っているのかも評価できるし。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666166722009133?via%3Dihub

RNA dot blotの抗体検出 削除/引用 No.12004-1 - 2023/12/12 (火) 05:09:08 - dsRNA dsRNAをふくむトータルRNA 1 ugをHybond N+メンブレンにスポット、1200 mJ/cm2のUVCで架橋したのち、5% スキムミルクでブロッキングして抗dsRNA抗体で検出するのですが、シグナルが全く見えません。免疫染色でdsRNAの再生は確認済みです。検出には何かコツがあるのでしょうか？

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