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(無題) 削除/引用 No.1199-9 - 2012/11/29 (木) 08:58:46 - でのそみ おおさんへ コメント、ありがとうございます。 なんでも新しい手法が良いというわけではなさそうですね。 自分の実験目的が何かを再考しながら、今後の参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1199-8 - 2012/11/28 (水) 22:47:03 - おお BNPAGEであればNature protocolsにはどのバッファーはHClでphを調整して、どれはしないとかのっていたとおもいます

(無題) 削除/引用 No.1199-7 - 2012/11/28 (水) 22:43:09 - おお BNPAGEはグラジエントでないときびしいとプロとコールにかいてました。あと、1000kdaとか巨大なものに適応できるようになってますのでそう言う意味では50kDaあたりのオリゴマーをみるにはさほど魅力をかんじません。たしかにゲルの濃度をいじればいいわけですけど。 従来のネイティブの電気えいどうのシステムでまずはやってみればどうでしょうか。 バッファーはBN用といっしょごたにしないほうがいいです(うまくいくかだれもわかりません)。

(無題) 削除/引用 No.1199-6 - 2012/11/28 (水) 21:34:13 - こるちん ajiさんへ > その20％ゲルを使っている論文は単にSDSと還元剤を抜く以外はSDS-PAGEの条件ではありませんか？全く違うタンパクではなく、あるタンパクのモノマーとオリゴマーを区別するのにBN-PAGEは必要ないようにも感じます。 全く御指摘の通りです。 Ab(1-42)のnative-PAGEの論文のmethodでは、SDSと還元剤を抜く以外でSDS-PAGEとの違いがよく分からないものばかりでした。 それで、native-PAGEについて調べていたら、最近はBN-PAGEがよく使われているようなので、私もBN-PAGEにしようかなと単純に思った次第です。 最初にSDSと還元剤を抜いただけのSDS-PAGE手法で試してみるのが良いかもしれません。 大変参考になりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1199-5 - 2012/11/28 (水) 20:58:12 - aji CBB-G250は和光のナカライで似た価格なので、同程度の純度だろうと思います。BN-PAGEが初めてなら、何か確実にBN-PAGEで判断できるサンプルがないとBN-PAGEがまともに動いているかどうかが分からないということになってしまいます。 その20％ゲルを使っている論文は単にSDSと還元剤を抜く以外はSDS-PAGEの条件ではありませんか？全く違うタンパクではなく、あるタンパクのモノマーとオリゴマーを区別するのにBN-PAGEは必要ないようにも感じます。

(無題) 削除/引用 No.1199-4 - 2012/11/28 (水) 20:50:12 - qq BN-PAGEをgoogleすると、まあ、色々出ますよ。

(無題) 削除/引用 No.1199-3 - 2012/11/28 (水) 20:12:48 - こるちん ajiさんへ コメントありがとうございます。 調べ方が不十分でした、もう少し調べてみます。 > 私はBN-PAGEはBis-Trisを使う初期の論文の組成かImidazoleを使う場合はNature protocolsの論文の通りにやっています。 Nature protocolsの論文はダウンロードできない(有料)ので、図書館で探そうと思っているところです。 > それ以外の組成を知らないだけなのですが、なぜゲルを通常のSDS-PAGEのようにするのかが疑問です。 BN-PAGEが初めてなので、最初の検討はコスト節約したかったことと、下記の理由からゲル組成を決めていました。少し考え方が安易だったかもしれません。 ・SDS-PAGEの手法からSDSやDTTを除けばnative-PAGEになるという記載があった。 ・Bis-Trisは購入しないと無い。 ・グラジエントゲルを作製する経験や設備がない。 ・Ab(1-42)のnative-PAGEを20% gelでおこなっている論文があった(ほとんどの論文はグラジエントゲルを用いていますが、、) > ちなみにCBB-G250Gの純度はかなり重要です。 > サンプルをのせるときに見やすいようにポンソーSを使うのもいいですよ。 参考にさせていただきます。ありがとうございます。 CBB-G250は、ナカライの電気泳動用特製試薬という規格の品が薬棚にあったので、これを使用しようと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1199-2 - 2012/11/28 (水) 18:51:04 - aji 私はBN-PAGEはBis-Trisを使う初期の論文の組成かImidazoleを使う場合はNature protocolsの論文の通りにやっています。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406264 それ以外の組成を知らないだけなのですが、なぜゲルを通常のSDS-PAGEのようにするのかが疑問です。 Invitrogenのゲルの説明書もかなり参考になると思います。 ちなみにCBB-G250Gの純度はかなり重要です。Serva社のものはお勧めで和光のでは出来なかったことは確かです。これだけInvitrogenのものを買うのも悪くないと思います。 サンプルをのせるときに見やすいようにポンソーSを使うのもいいですよ。 いずれにしてもNature protocolsを参考にするのがいいと思います。 アミロイドβについての論文があって、その条件を参考にしているというのであればそれに従えばいいのかと思います。

オリゴマーβアミロイドのBlue native-PAGE 削除/引用 No.1199-1 - 2012/11/28 (水) 18:06:05 - こるちん アミロイドβ(1-42)(Ab(1-42)、4kDa)のオリゴマー化をblue native-PAGE(BN-PAGE)で検出したいと思っています。 いろいろ調べた挙句に下記のBuffer・gel組成になったのですが、native-PAGEの経験がなく、これで大丈夫かどうか不安です。 「ここがおかしいっ!!」という点があれば御指摘頂けないでしょうか？ 特に、泳動バッファーのpH調整にHClを使用して大丈夫なのか不安です(Cl−イオンの添加)。 長文で申し訳ありませんが、どなたか御助言を宜しくお願い致します。 【Cathode buffer】下記組成をx10で調整予定です。 ⇒50mM Tricine, 7.5mM Imidazol, 0.02% CBB-G250, ajust to pH7.0 by HCl 【Anode buffer】下記組成をx10で調整予定です。 ⇒25mM Imidazol, ajust to pH7.0 by HCl 【Sample buffer】下記組成をx10で調整予定です。濃度の都合でGlycerolは2%にしました。ウェルにアプライするときに、多少でも比重を重くする目的です。 ⇒50mM Imidazole(pH7.0), 50mM NaCl, 5mM 6-aminohexanoic acid, 0.5% CBB-G250, 0.1% Digitonin, 2% glycerol 【Gel】ゲルはSDS-PAGE用の組成からSDSを除いたものになります。最初は20%の固定ゲルで検討して、上手くいかなかったらプレキャストのグラジエントゲルを購入しようと思っています。 ⇒Separation gel buffer : 1.5M Tris-HCl pH8.8 ⇒Stacking gel buffer : 0.5M Tris-HCl ph6.8 ⇒30% Acrylamide/Bis (30:0.8)

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