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(無題) 削除/引用 No.11981-7 - 2023/12/13 (水) 17:13:19 - U 通常のwestern blottingで使用するPVDFもしくはニトロセルロース膜の性能では膜に保持できるのは10KDa前後までで、それ以下の大きさのペプチドは膜に保持するのが難しいためFlag配列のような低分子量ペプチドの検出は困難と思われます。なので何も検出できないことは変ではない、というかむしろ自然です。低分子量ペプチド用の特別な膜も市販されていますが、それでも３KDa前後が限界ではないかと思います。 空ベクターのトランスフェクション は、トランスフェクション の行為そのものが結果に予期せぬ影響与えていないことを示すひとつのやり方として、大切と思います。

(無題) 削除/引用 No.11981-6 - 2023/12/09 (土) 05:17:03 - おお ついでだから書いておきますが、タンパクが分解される場合まず１０アミノ酸前後のポリペプチドに分解されて、それらのポリペプチドはTripeptidyl peptidasesによって３アミノ酸のオリゴペプチドに分解されたあとアミノ酸まで加水分解されるというスキームがあります。なのでFLAGの部分だけ発現しても分解途中のペプチドと認識される可能性が高いと思ってます。 ＞プラスミド導入実験のネガコンならただのセルライセートでいいような… これは一般的にどの程度アクセプトされているのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.11981-5 - 2023/12/07 (木) 15:20:36 - ああ プラスミド導入実験のネガコンならただのセルライセートでいいような… 質問の場合について理論上では低分子のバンドが一番下のマーカーの少し下に見えると思います ただ低分子（それも約1kDa）だと早く流れるのと低分子はメンブレンをすり抜けてしまうので実際には何も見えないかと。 やるならGFPとか適当なタンパクくっつけてみては？

(無題) 削除/引用 No.11981-4 - 2023/12/07 (木) 14:59:36 - 名無し 解決しました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11981-3 - 2023/12/07 (木) 12:18:52 - おお 実際に確認したことはありませんのではっきりしたことは言えません。FLAGで１kDa強、３xFLAGで３kDa弱。普通のタンパク質を見るゲルでは分解能がなく、最速で流れ泳動で先端を走ります。その部分は数kDa以下のタンパクが濃縮されていて、抗体によってはノンスペ（もしかしたら分解産物かもしれない）のシグナルがでます。そんなところに飲み込まれていれば確認することはできません。 それでも低分子の分解能があるゲルで流してもおそらくバンドが出ないとは思っていて、それはからベクター発現のIPフラクションを泳動しても、先端を走るペプチドのところに強いシグナルを認めたことがありません。 からベクターの場合、特にC末につけるようなものであれば、メチオニンがないとか、上流にメチオニンがあってもフレームがあってないこともあります。要するに発現しない。

(無題) 削除/引用 No.11981-2 - 2023/12/07 (木) 11:43:30 - 774R よほど低分子に特化した電気泳動＋トランスファー条件出ない限り、FLAGタグのみだとWBでは検出されないでしょうね。

タグ付きempty vectorを用いたWBについて 削除/引用 No.11981-1 - 2023/12/07 (木) 11:41:23 - 名無し 大学1年生です Flag-目的タンパク質のプラスミドが細胞に導入されたかどうかを確認する実験です。 ウェスタンブロッティングでネガティブコントロールとしてFlagタグ付きempty vectorを用いることを考えています。1次抗体としてFlag抗体を用いた場合、ネガティブコントロールの結果は�@バンドはない�AFlagタグタンパク質のみ転写・翻訳されたので低分子量のバンドがある　のいずれでしょうか。 初歩的な質問ですいません。

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