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CcdBが入っているプラスミドでは？ 削除/引用 No.11977-10 - 2024/02/21 (水) 05:46:00 - oyaji "おお"さんが書いていることが、おそらく正解かと思います。 サブクローニング用にCcdBが入っているプラスミドにインサートを入れた。 それを遺伝子組み換え・・・CcdBがついたまま、コンストラクト作製。・・・これでは？ CcdBは500塩基もないはず。よく使われているものは、lacプロモーターの下流にαペプチドに該当する塩基配列とCcdBをつなげたもの(SnaBIで結合)。インサートを入れたため、フレームシフト、あるいは遺伝子が長くなり、CcdB活性が低下・・・IPTG存在下では大腸菌増殖阻害効果がなくなり、培養可能・・・という流れかと思います。CcdBはDNA合成を遅らせ、細胞増殖しにくくする遺伝子。大腸菌と真核細胞ではDNA合成経路は若干異なるはず。 DH5αはCcdB感受性ありだったはず。

(無題) 削除/引用 No.11977-9 - 2023/12/07 (木) 06:45:57 - G25 ああ、lac proが二つあるんですね。

(無題) 削除/引用 No.11977-8 - 2023/12/06 (水) 23:36:32 - おお >[Re:7] G25さんは書きました : > T7 proもlac proもccdBとは逆向きみたいだが、 ん、そうですか？adgeneのマップではlac proのアローヘッドが、HAL、ピューロの方を向いていて、ずーっとすすんでいくとccdBと同じ方向向いている様に見えますが。T7はマップを指で思いっきり拡大すると逆になってるように見えますけど。

(無題) 削除/引用 No.11977-7 - 2023/12/06 (水) 20:03:01 - G25 T7 proもlac proもccdBとは逆向きみたいだが、

(無題) 削除/引用 No.11977-6 - 2023/12/06 (水) 18:17:15 - おお T7プロモーターはT7ファージRNAポリメラーゼがないと発現しません。ずっと上流を辿っていくとLacプロモーターがあるので、そこから発現するようになっていたけどインサートを入れているので、CcdB のプロモーターとして機能しない。 恐らくこのベクターを使ってコンストラクションしたのだと思う。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/topo/high-fidelity-blunt-end-topo-cloning/topo-blunt-subcloning.html Lac プロモーター直後にSP6がありマルチクローニングサイト、T7と続いている。このベクターだと、T7はSP6の方を向いているので例えT7ファージRNAポリメラーゼがあったとしても方向が逆でccdBは発現しない。

感謝 削除/引用 No.11977-5 - 2023/12/06 (水) 17:37:23 - ｃｃｄB みなさまご教示ありがとうございます。 一応ccdBの上流にT7プロモーターがあるのですが、これまでこの配列が入ったプラスミドをDH5a株に形質転換したところ、問題なく大腸菌は増殖しますので、おそらく元となったプラスミドの残骸で、機能しない短いccdBって可能性が高いかと思います。みなさまいろいろとコメントをありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11977-4 - 2023/12/06 (水) 15:16:24 - おお LacZの活性で青白判定でインサートが見分けられるプラスミドはご存知とおもいますが、LacZの代わりにccdBが入っていてインサートが入ってない場合ccdBが発現して死滅して、インサートが入った物だけコロニーを作ると言うベクターがあります(LacZならあおいコロニーになる)。 お示しのベクターはマップを見ると、そう言うccdBが入ったベクターを利用して、インサートをいれてコンストラクションしたもので、すでにccdB発現ユニットが壊れて発現しないようになっているように見えます。

(無題) 削除/引用 No.11977-3 - 2023/12/06 (水) 13:46:34 - 774R ccdBはあってもそれを発現するプロモーターが無くなってるとか？

(無題) 削除/引用 No.11977-2 - 2023/12/06 (水) 13:18:01 - mp DH5alphaは耐性ではありません。 生えてきたのはccdBに変異が入ったか、ccdBが欠失したプラスミドを持つものと予想します。 1.2 kbと言うのは汎用されているCmRを含んだカセットの長さではないでしょうか？

プラスミドのccdB配列について 削除/引用 No.11977-1 - 2023/12/06 (水) 12:23:21 - ｃｃｄB モレキュラーでプラスミドの構造について詳しい方ご教示をお願い致します。 Addgeneでプラスミドを眺めていたのですが、例えばAAVS1-CAG-hrGFP (Plasmid #52344)のようにホモロジーアームHA-Rの後ろにccdBの配列があって、いつもは気にせずにDH5aに形質転換していたのですが、よくよく調べてみるとccdB配列は大腸菌にアポトーシスを引き起こすってわかりました。 ってことはDH5a株はccdB耐性を持っているってことですか？ あと上記のプラスミドのccdB遺伝子は約500bpくらいでしたが、ChatGPTにccdBの配列の長さを聞いてみると1.2kbpって答えたのですが...プラスミドに入っている500bpの配列でもアポトーシス様に機能するのでしょうか？

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