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(無題) 削除/引用 No.11962-9 - 2023/12/02 (土) 12:09:30 - tts 他の方が指摘している部分を避けてコメントさせていただくと、 インタラクションを評価するのに細胞系を使用するメリットは薄いのでは？ (記載いただけてないだけかもしれませんが、、) インビトロでELISAなりSPR法などで評価した方がクリアな結果が得られそうに思います。 個人的には、実験毎のトランスフェクション効率の誤差がいつも気になる次第です。 またタグ付けタンパクの結果の違いについても、タグ付けすることでインタラクションに影響するような構造への影響はないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11962-8 - 2023/12/02 (土) 04:06:44 - おお 同じようなドメインが、Cの同じところに結合するのならば、精製A、B、Cを用意して競合するかを見る実験をすれば、競合するはずです。もちろん実験してないので結論付けられませんが、あなたの実験結果をみた人はそういう事を思いながら結果についてどうとらえるのか聞いてくるとおもいます。だからHAの結果が正しいのが理にかなっているけどなぜMycのデーターをあえて示すのかということです。またHAで競合している事が示せたとしても、コンプレックスの量が減ったとしてもそれでも十分なシグナルを下流に流せる可能性もあります。 でこの実験の着目点は何なのかというのを整理してほしい気がします。 １）生化学的観点から競合するかどうかを示したい。 ２）細胞レベルでBの発現の増減はAの結合にあまり影響を与えないということを示したい。 １）のばあい細胞でやるのはあまりにも雑です。 ２）のばあい過剰発現で実験するにはどうなのかなぁと思います。発現量の調整とか色々な面で正確な実験ができないような気がしますし、「Aの結合にあまり影響を与えない」というあやふやな部分をどうするのかとも思います。BがAより５倍の発現があっても、ACの結合は半分くらいまでしか落ちないから、ACの影響は細胞で維持されている、あるいはされてないというように着地点が見つかりません。他の実験の結果などを合わせて考えるなら別ですけど。 ACは細胞内で発現しているものを見るためにBだけ発現して差を見るほうがどうもスッキリします（もちろんBの発現によりACが影響を受ける可能性は排除できないですけど）。違うアプローチだと色々なBの発現量の細胞株を集めエンドのACの結合具合を見るというのもわかりやすいかもしれません。 最後にACの複合体はBの発現に細胞内では影響されないということになれば、生化学的には競合してもおかしくないものがそうではないという結論になります。ではその矛盾にどのように答えるのかについて少し実験が必要なきもします。その点も今持っている他の実験結果との兼ね合いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11962-7 - 2023/12/01 (金) 12:33:37 - おお >[Re:4] 免疫沈降経験者さんは書きました : > >おお様 > > お返事ありがとうございます > 個人的には今回の場合、同じタグ付きの実験系が良くないかなー（違うタグ付き実験と比べて綺麗にでない）と思っているのですが、 検出感度の差の様に思える。綺麗に出ないから実験系が良くないといきなり結びつけていいのか分からない。もしかしてCのシグナルが強くてみずらくなってません？ >ボスが同じタグ付きでの実験にこだわっているのでやっているのですが、 恐らく一つのレーンで比が取れるからじゃないですか？ そうするとmyc の場合はどうやってけいさんするの？ IPされたCの量ベースでしかもLysateの発現量も影響してくる。HAでも同じ問題を抱えているでしょうけど。 >タグが変わればタンパク質の相互作用に影響が出るということなんてあるのでしょうか？　 否定は出来ません。 全てHAの時IPでCと他のタンパクの比率はずどんなもんでしょうか？Cがあからさまに多いいとAもBも結合した上でCがかなり残っていたなら、競合するほどAとBの量がなかったってことになる。 > そもそもエンドがかなりあるなら、タグで見ても正確なデーターにならないよ それと導入はどのようにやってるの？ ちょっとねみいから、一旦区切る

(無題) 削除/引用 No.11962-6 - 2023/12/01 (金) 11:35:32 - み 細かい事を言うとHA-BとMyc-Bの導入効率、蛋白発現効率（分子モル数）が同等であったか気になる。 プラスミド精製度が少し違うだけでも効率違ってくる。 遺伝子発現プロモーターも同じなのか。

(無題) 削除/引用 No.11962-5 - 2023/12/01 (金) 11:24:16 - あああ Myc-Bタンパク使用時のA・B共発現時のBのバンドがHAより弱まってないですよね？ 一応AとBが競合するけどMycによってBとCとの結合が抑制され結果としてA単体とA＆Bで同じに見えているという可能性は排除したほうがいいので…

(無題) 削除/引用 No.11962-4 - 2023/12/01 (金) 05:26:35 - 免疫沈降経験者 >おお様 お返事ありがとうございます。 確かに違うタグ付きの実験はバンドが綺麗に出て再現性もあり、納得のいく結果なのですが、同じタグ付きの免疫沈降はこれまで3度したのですが、あまり精度は良くありません(めちゃくちゃはっきりバンドがバシ！と出ているわけではありません。評価すると差が出ているといった感じです。) 個人的には今回の場合、同じタグ付きの実験系が良くないかなー（違うタグ付き実験と比べて綺麗にでない）と思っているのですが、ボスが同じタグ付きでの実験にこだわっているのでやっているのですが、タグが変わればタンパク質の相互作用に影響が出るということなんてあるのでしょうか？　 >774R様 ありがとうございます。 cell lysateでの発現の差はあまり変化は見られないと思っておりましたが、ブロットの定量化(近赤外蛍光 LICORのImage studio)をしてみたところ、少し共発現時にAの発現が落ちておりました。ただ見た目的にはあまり変わりないんですが、確かに影響を受けているのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11962-3 - 2023/12/01 (金) 03:46:54 - 774R AやBやCの発現量は、共発現することで変化はないですか？ 相互作用するタンパク同士だとありがちです。 すなわち、インプットの量もIPされてくる量に影響を与えるので注意が必要です。 今回のように、競合的に結合することが示唆されてる場合は尚のこと発現量が影響してきます。

(無題) 削除/引用 No.11962-2 - 2023/12/01 (金) 01:27:19 - おお 後で詳しく書けるかもしれませんが、その実験の精度において結論が出せるのか疑問ではある。同じタグがついていてもサイズで認識がはっきりできるなら、そこは問題ないはず。

タグ付き免疫沈降の実験結果の違い 削除/引用 No.11962-1 - 2023/11/30 (木) 23:44:45 - 免疫沈降経験者 タグ付きの免疫沈降に関する質問です。 今分かっていることとしてタンパク質AとBがタンパク質Cに結合することがわかっています。 AとBは同じようなドメイン構造を持っており、AとBに共通するドメインがCに結合し、AとBもそのドメインを介して結合しております。 今AとCの結合に対してBの存在が影響するかという実験をしていますが、HEK２９３TcellにHA-Aタンパク、HA-Bタンパク、HA-Cタンパクを強発現させ、Cタンパク抗体で免疫沈降し、HA抗体を用いてWBでAタンパク、Bタンパク、Cタンパクを描出したところ、Aタンパクを単独発現させたよりも、AとBを共発現をした方がAとCの結合が弱く見える結果となりました。同じくBとCとの結合もAの存在下では弱くなっていました。 しかし、同じように今度はHA-Aタンパク、Myc-Bタンパク、HA-Cタンパクを強発現させて、Cタンパク抗体で免疫沈降し、AタンパクはHA抗体で、BタンパクはMyc抗体でWBで描出させたところ、Aタンパクの単独発現時とAとBを共発現時のタンパク質AとCの結合に差はありませんでした。 どちらの結果が正しいのか分かりませんが、描出させたい２つのプレイタンパク質を同じタグ付き（しかもプレイタンパク質同士は結合している）に強発現させて、免疫沈降してもよろしいものなのでしょうか？ ボスに言われるがまましたのですが、同じタグなら２つを認識するのが難しく見かけ上１/2, 1/2 になってしまうから上記のような結果となってしまったとも考えられるかなと思ったのですが、そんなことありえますでしょうか？ 結果的にBの存在下でもAとCの結合に影響を及ぼさないという方が、仮説的には正しいのですが、実験結果の違いの解釈に困っております。 教えていただければ幸いです。

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