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(無題) 削除/引用 No.11955-15 - 2023/11/30 (木) 18:30:37 - G25 >耐性遺伝子の断片が入っただけでもコロニーが形成されると、とある名誉教授が言ってましたが、それは嘘ですか？ それは直鎖の断片が細胞中にフラフラしていても耐性遺伝子が機能すると言っているわけじゃないでしょ。 ゲノムにインテグレーションされて複製と発現が可能になっているというだけで。 フリーの二重鎖切断（DSB)末端をもったDNA断片がby chanceでゲノムにインテグレーションのは頻度が高いわけじゃないけれど稀な現象ではないですね。 DSB末端は修復系の標的になるのでそういうことも起こります。 またNHEJ様（大腸菌のはカノニカルなNHEJ系ではないそううだが）のDSB修復系で直鎖DNAが環状化されるということもありえます。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2836643/ でもそれで生えてきたコロニーはあくまでも直鎖状DNAではなく、クローニングサイトの継ぎ目の配列が崩れてはいてもちゃんと環状プラスミドをもっているわけです。 どちらにしても当たり前のことのごとく「直鎖化したプラスミドを大腸菌に入ると薬剤耐性のコロニーが生えるものだ」と主張するようなものではない。 実際のところ、頻々と直鎖状のDNAによってコロニーが生じるのだとしたら、プラスミドでクローニングをしていてもっと難しい実験になっているはずだけど、そうではないでしょ。それが原因で困ったということありますか？ 質問の意図は、直鎖化したプラスミドも大腸菌に入るはずだけど、それによって生えてきたとコロニーがないように見えるのはなぜかということでしょう。それ対して、否、こういう現象でコロニーが生えることもあるとか言うのは論点がずれてないか。

(無題) 削除/引用 No.11955-14 - 2023/11/30 (木) 18:24:09 - YyY 皆様 ご返信＆活発な議論ありがとうございます。 聞きたかったこと以上に色々なことが知れて大変参考になりました。 また、気になったことはすぐ掲示板で聞くのではなく、極力自身で調べるよう努めます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11955-13 - 2023/11/30 (木) 14:29:07 - おお >[Re:11] wwwさんは書きました : > おお様 > > 回答ありがとうございます。 > 大腸菌ゲノムへインテグレートされる頻度はどの程度でしょうか？ > 通常のトランスフォーメーションをしたときに数十個とかの頻度で出てくるでしょうか？ 専門外なので頻度は知りません。 また、ご自身の疑問は新しくトピックを立てたほうがいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.11955-12 - 2023/11/30 (木) 14:26:07 - おお >[Re:9] wwwさんは書きました : > 「T7プロモーターはヒト細胞でも機能します」とも言ってます。 > https://x.com/molbio08/status/1652873398278832128?s=20 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/037811199390302J?via%3Dihub そういう論文はあるね。ただしpGEMでT7プロモーターが働いているという主張をしているようです。ほかでどうか言及されているかわからない。

(無題) 削除/引用 No.11955-11 - 2023/11/30 (木) 14:09:32 - www おお様 回答ありがとうございます。 大腸菌ゲノムへインテグレートされる頻度はどの程度でしょうか？ 通常のトランスフォーメーションをしたときに数十個とかの頻度で出てくるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11955-10 - 2023/11/30 (木) 14:02:07 - おお >[Re:7] wwwさんは書きました : > 耐性遺伝子の断片が入っただけでもコロニーが形成されると、とある名誉教授が言ってましたが、それは嘘ですか？ ゲノムにインテグレートされたりするってことでしょう。 Oriがついていたなら、直鎖でも低頻度ながら環状に修復されてエピソーマルにふえる事もあります。

(無題) 削除/引用 No.11955-9 - 2023/11/30 (木) 13:54:05 - www 「T7プロモーターはヒト細胞でも機能します」とも言ってます。 https://x.com/molbio08/status/1652873398278832128?s=20 プロフィールは以下のとおりだそうです。 「専門分野は分子腫瘍学・分子生物学。抗体を活用した研究を行ってきました。腫瘍免疫は重要なテーマなので免疫学も守備範囲。大学で教えています。」

(無題) 削除/引用 No.11955-8 - 2023/11/30 (木) 13:52:18 - www これです。 https://x.com/molbio08/status/1652798591688413185?s=20

(無題) 削除/引用 No.11955-7 - 2023/11/30 (木) 13:42:42 - www 耐性遺伝子の断片が入っただけでもコロニーが形成されると、とある名誉教授が言ってましたが、それは嘘ですか？

(無題) 削除/引用 No.11955-6 - 2023/11/30 (木) 12:41:06 - G25 直鎖化したプラスミドだといろいろ不都合はあると思いますが、 （例えばフリーの二重鎖切断末端をもつDNAは細胞内で安定に維持されないとか）、複製できないということだけとってもコロニーはできません。 プラスミドの複製はoriから始まりますが、直鎖になったらoriより上流は複製されない。oriが上流側末端にくるような直鎖だったら全長複製されるかもしれないけど、クローニングサイトで直鎖状にしたのならそうはならない。 もっというと、プラスミドの複製(すくなくともベクターに使われるpMB系のレプリコン）はローリングサークル型複製といって環状DNAに特化した特殊な複製方法なので直鎖化したらだめでしょう。 一個の細胞に一個のプラスミドが入ったとして、それが複製してコピー数を増やさなければ、娘細胞に分配されることはありません（一細胞あたりのコピー数も薬剤耐性に十分で無いかもしれない）。せいぜい姉妹のどちらかに1コピー残るだけ。

(無題) 削除/引用 No.11955-5 - 2023/11/30 (木) 02:45:08 - おお >[Re:4] YyYさんは書きました : > ＞複製で末端が削れるのは > 勉強不足で上記がよくわからなかったのですが、複製で末端が削れるというのはどういった現象になるでしょうか？ 知的好奇心も高く、分からないことを積極的に聞く態度は素晴らしいと思うのですが、ご自身で調べる術を身につけると色々な意味でメリットがあると思いますのであえて解説はしません。生物学、生化学などの教科書になるような本に載っていると思いますのでお調べになってください。 複製、プライマーゼ、岡崎フラグメント、5’-end problem、テロメアなどがキーワードです。

(無題) 削除/引用 No.11955-4 - 2023/11/29 (水) 21:33:55 - YyY おお様 ご返信ありがとうございます。 ＞複製で末端が削れるのは 勉強不足で上記がよくわからなかったのですが、複製で末端が削れるというのはどういった現象になるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11955-3 - 2023/11/29 (水) 00:49:54 - おお 仮に安定だとしても、複製で末端が削れるのは真核生物でも問題になる。

(無題) 削除/引用 No.11955-2 - 2023/11/29 (水) 00:26:22 - おお 直鎖の末端はexonuclease のターゲットになるからかな。

YyY 削除/引用 No.11955-1 - 2023/11/29 (水) 00:08:37 - プラスミドのコロニーについて すみません、わかる方いればご教授お願い致します。 インサートを組み込んだプラスミドのクローニングについて疑問に思う事が有ります。 プラスミドが入ってない大腸菌は、プレート上で増えない(コロニー形成しない)かと思いますが、それと同様にインサートが入ってないプラスミド(直鎖上のまま)もプレート上でほぼ増えない(コロニー形成しない)と思います。増えない具体的な理由は何故なのでしょうか？ 直鎖状ですが、薬剤耐性遺伝子自体はベクター上に載っているので、耐性を持たないのでしょうか？

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