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(無題) 削除/引用 No.11923-3 - 2023/11/17 (金) 02:47:46 - 免疫沈降経験者 ＞おお様 お返事ありがとうございます。 確かに２９３を用いたsemi-endogenousIPではうまくいったので、とりあえず２９３　cellを用いて、同じような系で実験をしたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11923-2 - 2023/11/16 (木) 11:58:27 - おお ビーズ上であぐりやすいタンパクなんじゃないでしょうか？一応ビーズでプレクリアをしているようですが、それでノンスぺ（ビーズに非特異的に結合するもの）がすべて除けでて、IPの時にノンスぺはくっつかないということはないです。軽減はされるでしょうけど。 あとLysateも一度遠心で不要物を除いても、オーバーナイトとか長期間の間にいくらか濁ってきてそういうのがビーズに絡まったり、あるいはノンスぺとしてくっついてしまったりもします。そういう場合は抗体とビーズを同時に入れて１時間ぐらいで回収してしまってもいいかもしれません。 ＞これはHA-抗体が非特異的にタンパク質Bと結合して、 確かのこの可能性を否定できないですが、たいていの場合はビーズに直接ついていると思います。 プラスミドが悪くてノンスぺが出るという話は聞いたことも考えたこともないですが、プラスミドの発現したいたんぱくの部分の配列がかしくなっていたらもしかしたらそうなのかもしれません（私は制限酵素などで確認しているならまずないと思いますが）。 対策として考えられることはもしかしたらたんぱくが相当過剰に発現して、あぐりげーしょんを起こしやすくなっているかもしれませんので、少し発現を抑える工夫をする。導入するDNA量を減らすか、量が減らせないなら空のベクターを混ぜて調節する。293TはプラスミドSV40оriがついていたら相当強い発言になりうるので、そういう場合は293でやってみるとか思い切ってほかの細胞を使うとか。HeLaぐらいなら発現量で困ることはないかなとおもし。 Lysateのタンパク濃度を低めにする。 Lysis bufferの界面活性剤を工夫する。示された組成に0.1%ぐらいのデオキシコール酸とかCHAPSを加えるだけでもノンスぺをかなり減られることがある。ただし場合によっては見たいたんぱくの結合によくない場合もある。 IGEPALをやめてデオキシコール酸とかCHAPSに変える手もある。 ビーズに吸着したノンスぺがなるだけ溶出しないように酸、アルカリに振るだけでIPしたビーズからたんぱくを遊離させる。 細胞をLysisする前にクロスリンカーで結合するたんぱく同士をコバレントに結合した状態でHigh stringentなバッファーでIPをする。

免疫沈降でのネガティブコントロールのバンド出現 削除/引用 No.11923-1 - 2023/11/16 (木) 06:51:49 - 免疫沈降経験者 タンパク質Aとタンパク質Bの結合ドメインを同定するために、HAタグ付きタンパク質AとFLAGタグ付きタンパク質BとそのmutantをHEK293TcellにOverexpressionさせ、HA抗体で共免疫沈降させて、タンパク質B抗体を用いてWBで結合ドメイン部位の同定を行なっています。 ・タンパク質の溶解Bufferは20mM Tris-HCL pH7.4, 150mM NaCl, 0.5% IGEPAL, 1mM EDTA, 1mM EGTAの組成で、洗浄Bufferはこれの塩濃度を３００mMとしたものとしています。 ・IP前に４Cで２時間程度Pre-cleaning　(アガロースビーズG slurry50%)後、上清を採取して、そこにHA抗体を加えて４CでRotatorで撹拌してOver night. ・翌日２時間、アガロースビーズGを加えて４Cで２時間、Rotaterで撹拌して、上清を除去してビーズを洗浄Bufferで5回洗浄（最後の洗浄時にエッペンドルフを交換）して、Sample buffer 2X (LICOR)で溶出。 上記工程でネガティブコントロール(HA-タンパク質Aを強発現させてないもの)と一緒にタンパク質B抗体でWBしたところ、ネガティブコントロールにポジティブなタンパク質Bの強いバンドを認めました。 既に２９３cellにHA-タグ付きタンパク質Bを強発現させて、タンパク質A抗体で共免疫沈降(semi-endogenous IP)して、タンパク質Aとタンパク質BとのinteractionはWBで確認しております。 追加実験で293TcellにFLAG付きタンパク質Bだけ強発現させて、ビーズのみ、ビーズ＋HA-抗体で免疫沈降させたところ、ビーズ＋HA抗体のサンプルにタンパク質Bのバンドを認めました。 これはHA-抗体が非特異的にタンパク質Bと結合して、ビーズにくっついてしまっているのでしょうか？それとも洗浄不足or 洗浄Bufferの条件が緩いせいでしょうか？ なお、本来ならFLAG抗体でタンパク質BをWBで描出したいところなんですが、なぜかFLAG抗体がうまく機能しません（今いるラボでこのプラスミドを用いた論文が10年ぐらい前にpublishはされているのですが、、、）。同じくmutantもタンパク質B抗体では描出されますが、FLAG抗体では描出されません。この使用しているプラスミドに問題があるから、ネガティブコントロールに非特異的バンドが出現している可能性もあるでしょうか？ 何かプロトコールでおかしなところがあれば指摘していただければ幸いです。よろしくお願いいたします。

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