BioTechnicalフォーラム [miniprepの培養液をmidiprep用に増やすと、プラスミドがとれない]

(無題)

No.11921-25 - 2023/11/20 (月) 17:03:16 - おお

>[Re:24] momoさんは書きました :
> アンピシリンの作用が静菌的だとされるのは承知していますが、標的は細胞壁合成ですので、静菌的であるというのは条件によりけりではないかと思っています。

おっしゃっているケースでそれは示されてないですよね。
>
> ファージのコンタミが原因かどうかはさすがに判断できます。

今後のために詳しく教えてください。

(無題)

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No.11921-23 - 2023/11/20 (月) 08:32:54 - おお

>[Re:19] momoさんは書きました :
> 40 mLから1 ugという値はタチの悪いプラスミドであれば普通にあります。そういうケースで無理やりプラスミドを調製しようとして、培養の途中で遠心で菌体を回収し新しいLB+Ampに植え継ぐことを繰り返してかなり改善をみたことがあります。このとき植え継いでしばらくすると濁度が一度ぐっと下がるので、プラスミドを落としたフラクションが多いのだと判断しました。

ファージがいたんじゃないかと思ったりもする。普通は濁度が下がると言うより、上がらないのでは、、、確かampは静菌的ですし。
>
> 特にタチが悪いプラスミドの場合はコロニーからスタートしてもそうなります。そのような場合には、これも既に何度も議論されていますが、30℃で培養して、当然収率は落ちるので培養のスケールを上げることになります。
>

毒性があるDNA配列があるだろうプラスミドでは、大腸菌が増えないと言うのはあります。そう言う時は多少でもより増える大腸菌株を探して、毒性を抑えるために30度で培養するとか。加えて抗生物質濃度を落とす。(両方ともプラスミドコピー数を減らす工夫)で凌ぐ事はまあまああります。回収直前に37度に戻すと、いくらか収量がふれるかもしれません。

それでも難しいなら、コロニーを懸濁してあるいはミニプレップの時の残りを新しいプレートに塗りつけて回収すると言うあらわざもなくはない。ただ普通にオーバーナイトでやると増え過ぎて死菌が増えるので、数時間で薄い膜が貼ってるような感じの時に回収するようにした方がいい。

(無題)

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No.11921-22 - 2023/11/20 (月) 07:57:00 - momo

> ちなみに、個人的にはそんなplasmidには出会ったことが無いです。めちゃめちゃlow copyのBacのライブラリーでも無いですね。

コピー数の問題ではなく、プラスミドを落とした菌が大部分になるということですから、この比較にはあまり意味が無いように思います。

> と有るので、plasmidでsequenceに回せるくらいなら、少なくとも最低限300-400ng/10 uL位無いと行えないわけですから、そこまで厄介なplasmidでは無いと予想できます。

このケースではプレート（常に選択が掛かり続ける条件）からのスタートですので、mini-prepでは問題なかったのだと思います。実際、私たちのケースでもそうでした。

> また、colonyから40 mL cultureで300 ugが再現良く取れることからも、そんな判断はおかしくないですか？

これも程度問題で何とも言えないと思います。結局のところ、プラスミドを持った菌と落とした菌の増殖速度の差が指数関数で効いてくるし、スタート時の菌数の差がどのくらい（どのくらいの菌がプラスミドを落としているか）はケースバイケースでしょうから。

(無題)

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No.11921-21 - 2023/11/19 (日) 22:10:45 - SYBR master

一個前、消せなくてすいません

>[Re:19] momoさんは書きました :
> 40 mLから1 ugという値はタチの悪いプラスミドであれば普通にあります。そういうケースで無理やりプラスミドを調製しようとして、培養の途中で遠心で菌体を回収し新しいLB+Ampに植え継ぐことを繰り返してかなり改善をみたことがあります。このとき植え継いでしばらくすると濁度が一度ぐっと下がるので、プラスミドを落としたフラクションが多いのだと判断しました。

ちなみに、個人的にはそんなplasmidには出会ったことが無いです。めちゃめちゃlow copyのBacのライブラリーでも無いですね。

またこの判断の前に、

>[Re:1] miniさんは書きました :
>Day2. その後、miniprepを行い、シークエンスを確認しました。この際、miniprepの培養液の残りは4℃で保存しました。

と有るので、plasmidでsequenceに回せるくらいなら、少なくとも最低限300-400ng/10 uL位無いと行えないわけですから、そこまで厄介なplasmidでは無いと予想できます。

また、colonyから40 mL cultureで300 ugが再現良く取れることからも、そんな判断はおかしくないですか？

(無題)

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No.11921-20 - 2023/11/19 (日) 22:01:54 - SYBR master

>[Re:19] momoさんは書きました :
> 40 mLから1 ugという値はタチの悪いプラスミドであれば普通にあります。そういうケースで無理やりプラスミドを調製しようとして、培養の途中で遠心で菌体を回収し新しいLB+Ampに植え継ぐことを繰り返してかなり改善をみたことがあります。このとき植え継いでしばらくすると濁度が一度ぐっと下がるので、プラスミドを落としたフラクションが多いのだと判断しました。
>
> 特にタチが悪いプラスミドの場合はコロニーからスタートしてもそうなります。そのような場合には、これも既に何度も議論されていますが、30℃で培養して、当然収率は落ちるので培養のスケールを上げることになります。
>
> 厄介なプラスミドでなくとも、通常の濃度のアンピシリンだと選択が掛かっているのは培養のごく初期のみと読んだことがあります。その後はプラスミドの安定性に頼って増やすことになるということであると理解しています。

(無題)

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No.11921-19 - 2023/11/19 (日) 16:36:29 - momo

40 mLから1 ugという値はタチの悪いプラスミドであれば普通にあります。そういうケースで無理やりプラスミドを調製しようとして、培養の途中で遠心で菌体を回収し新しいLB+Ampに植え継ぐことを繰り返してかなり改善をみたことがあります。このとき植え継いでしばらくすると濁度が一度ぐっと下がるので、プラスミドを落としたフラクションが多いのだと判断しました。

特にタチが悪いプラスミドの場合はコロニーからスタートしてもそうなります。そのような場合には、これも既に何度も議論されていますが、30℃で培養して、当然収率は落ちるので培養のスケールを上げることになります。

厄介なプラスミドでなくとも、通常の濃度のアンピシリンだと選択が掛かっているのは培養のごく初期のみと読んだことがあります。その後はプラスミドの安定性に頼って増やすことになるということであると理解しています。

(無題)

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No.11921-18 - 2023/11/18 (土) 19:23:59 - SYBR master

>[Re:17] momoさんは書きました :
> ご自身も疑っておられるように、私も0.1 uLは0.1 mLの書き間違いだと判断しました。

ごめん、少し強く書きすぎた、反省します。

ただ、ぼく自身はこのトピ主は多分単位間違いはしていないと思っています。ので、単に菌体量少ないだけでは無いかと思っています。例え0.1mLでも、トピ主が書いた40 mLから1マイクログラムしか取れないことはちょっと考えにくいです。

(無題)

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No.11921-16 - 2023/11/18 (土) 15:06:50 - SYBR master

>[Re:14] momoさんは書きました :
> 液培から植え継いでプラスミドの収率が落ちて困っているというのは、

どや顔で書いているのかもしれませんが、そんなことは知っています。

私が指摘しているのは、「0.1uLでは「初期菌体量」がコロニーよりも少ない」ことを指しています。「初期菌体量が少なければ、最終菌体量も少なくなる＝プラスミドが少ない」のは当たり前じゃ無いですか、と言うことです。

ちなみに、植え継ぐ菌体液量が、最終液量の1/500から1/1000であることは、実験に関する教科書で書かれていることだと思うんですが、違いますか？(確認したら1/500って書いてあったわ)

そもそも、「前培養の培地中のβ-ラクタマーゼ」なんて、1000倍希釈されたら次の培養にはほとんど影響ないです(そのために高濃度のアンピシリン添加しているでしょ）。また0.1uLを40mLにしたら、40万倍に希釈されているんですよ？それで影響出るレベルのβ-ラクタマーゼが有るって、数の概念吹っ飛んでると思います。

(無題)

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No.11921-15 - 2023/11/18 (土) 14:04:05 - おお

>[Re:14] momoさんは書きました :
> 液培から植え継いでプラスミドの収率が落ちて困っているというのは、このフォーラムではFAQです。
>
> G25さんがお書きになっているように、前培養の培地にはβ-ラクタマーゼがしこたま分泌されているので、植え継いだ途端に本培養のアンピシリンは分解され、以後選択なしで培養されることになります。プラスミドが積極的に排除されるわけではないので、大腸菌の生育に悪さをしないプラスミドであればそれでも問題なく取れますが、わずかでも生育に影響するものであればプラスミドを落とした大腸菌が培養の大部分を占めることになります。
>
> これを避けるにはコロニーから直接培養するか、本培養に持ち込む前に菌体を培地等で洗うことです。

カナマイシンだったら収量が落ちる事はぜったいないということですかねぇ。。。

(無題)

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No.11921-14 - 2023/11/18 (土) 11:17:41 - momo

液培から植え継いでプラスミドの収率が落ちて困っているというのは、このフォーラムではFAQです。

G25さんがお書きになっているように、前培養の培地にはβ-ラクタマーゼがしこたま分泌されているので、植え継いだ途端に本培養のアンピシリンは分解され、以後選択なしで培養されることになります。プラスミドが積極的に排除されるわけではないので、大腸菌の生育に悪さをしないプラスミドであればそれでも問題なく取れますが、わずかでも生育に影響するものであればプラスミドを落とした大腸菌が培養の大部分を占めることになります。

これを避けるにはコロニーから直接培養するか、本培養に持ち込む前に菌体を培地等で洗うことです。

(無題)

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No.11921-13 - 2023/11/17 (金) 01:26:14 - SYBR master

>[Re:1] miniさんは書きました :
> Day3. シークエンスが正しかった培養液の残りを0.1uLとり、40mLのLB-ampに入れ、一晩培養しました。

0.1uLって良くその量取れたよね？って言う量だけど、単位間違っていない？

ちなみに、うちでは当該培養量の1/1000を植え継ぎの作法なんだけど（同一状況なら、40マイクロ）使うけど、これって普通なの？

(無題)

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No.11921-12 - 2023/11/16 (木) 23:16:32 - 経験則

解決自体は一般的な方法で
miniでpickupしたコロニーで
マスタープレート作っておいてそこからMIDI用の種を取ればいいんだろうけど
（って全員言ってるな・・）

未知の反応液のTF液撒いたプレート由来と
既知のplasmidのTFプレート由来を比べれば
純粋？さの違いで既知の方が良さそうなイメージはある。
転換効率でも顕著な差はあるだろうし。
種となる大腸菌4℃保存が悪影響であれば
マスタープレートをシールして冷蔵保存している時点でアウトじゃない。

ここだけの話
Ctrlで大量消費するようなplasmidなんかを補充で準備する際
前回40mL培養した後に滅菌せず空のフラスコを冷蔵保存しておいて
後日新しいLBampを40mL入れて一晩培養する
こんなのでも十分な収量（500ug）は得られたりはする。
※ただのズボラで全シーケンスなんかしないから
　なにかしらの変異が入ってる可能性は無きにしも非ず

MIDIのKitのメーカープロトコルにOD指定するほど厳密な調整がないなら
40mLで1晩振った細胞量って環境に依るから
冷蔵保存した培養液0.1mL（だよね？）を40mLに入れて一晩と
TFしなおしたコロニーから40mLを一晩
で細胞量もしくはplasmid総量に違いがあるから
Kit通りの試薬量でうまくいってない気がする。
これが原因なら
中和段階より変性後の上清or濾液に対するBinding Bufferの量が影響でかいと思うから
既定が10mLなら8mL 6mL 4mLくらいに減らしてみたら
最大収量が得られる域はありそう

(無題)

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No.11921-8 - 2023/11/16 (木) 03:29:26 - おお

これって、少し経験を積めばたまに起こるので、ありえないことが起こっているという感覚はないです。

コロニーということは均一の菌の集団という理屈ですが、Transformation後のコロニーは実は１００％そうと言い切れないわけです。例えばTransformation直後は菌体の中に複数のプラスミドが入っていて、それが分裂時に分配されながら淘汰されていくわけですが、淘汰されるということはなくなるということではなく、マイナーな集団のままでいるということです。加えて、プレート上では大腸菌の増殖は安定しているので、生理的に都合が悪いことがあってもそこそこしっかりと増殖してくれる。液体培地ではそこまで増殖を支えてくれないので、ヘテロであったらプラスミドが生理的に都合が悪い場合はそういう菌は多少なりとも増殖に差がついてマイナーなポピュレーションになることがまあまあある。という感じのことが起こっているというのが、経験的なものを含めての感想です（完全に科学的とまで言えない妄想も含んでいると思う）。

で解決方法ですが、コロニー拾ったら、ミニプレップ後でも前でもいいから、そのコロニーを線画培養してそこからピックアップするとより完全な均一な集団から培養に移せるので、ほかの混じり物に淘汰されることがなくなるといってもいいでしょう。上記の妄想の説明は、いがいとこれでうまくいくからです。

(無題)

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No.11921-7 - 2023/11/15 (水) 23:44:42 - G25

> 一方で、miniprepでとれたプラスミドを再度プレートに蒔き、コロニーをピックアップし、40mL培養、midiprepをすると300ugくらいとれます。

精製したプラスミドで大腸菌を形質転換してプレーティングして生じたコロニーを液体培養したってことですね。
わざわざそんな手間かけんでも、オリジナルのコロニーを釣った時にマスタープレートに植えてから液体培地に接種しとけばいいじゃない。再培養はマスターから始めればいい。
って、そうするのがコンベンショナルな作法でないかい。

(無題)

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No.11921-5 - 2023/11/15 (水) 22:09:52 - G25

アンピシリン選択かね。
一晩培養液の培地中には分泌されたβラクラマーゼがいぱい。
スターターとして植え継ぐと、早速、培地中のアンピシリンを分解するので、アンピシリンの力価が下がる。結果、プラスミドが抜けた非形質転換体が優位に増えてプラスミドの収量が下がる。
なんてこともある。

アンピシリンの力価が十分ならそうそう起こることではないかもしれないが、
元々、アンピシリンが保存中に劣化して力価がギリギリの線だったかもしれない。
アンプを新調するか、量を多めにしたらいいかもしれない。
前培養からのβラクタマーゼの持ち込みを気にする人は、一旦、遠心して上清を入れ換えて使ったりするらしい。

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