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(無題) 削除/引用 No.11919-8 - 2023/11/16 (木) 13:18:46 - G25 大腸菌からの大量タンパク質を精製するときも、あえて界面活性剤を使いたくないときは、LysozymeとFreeze/Thaw cycle, あるいはsonicationを組み合わせて溶菌する。 界面活性剤を一旦入れてしまうと、ミセルをつくったりして簡単に透析なんかでは除去できないので、ダウンストリームの実験に影響があるときは（脂質膜に組み込むとか）最初から界面活性剤を使わないのも選択肢。

(無題) 削除/引用 No.11919-7 - 2023/11/16 (木) 03:08:58 - おお どうしても外膜が気になり、界面活性剤は使いたくないというなら先ほど述べた凍結融解とか、グラスビーズを入れてボルテックスして物理的に膜を痛めるとか、超音波破砕とかいくらかやりようがあると思う。

(無題) 削除/引用 No.11919-6 - 2023/11/15 (水) 18:54:00 - G25 >Triton X-100を1%、DNase、Lysozyme それはまさに、大腸菌で発現させたタンパク質を回収するために溶菌するための典型的なレシピのひとつ。

(無題) 削除/引用 No.11919-5 - 2023/11/15 (水) 12:55:35 - おお >[Re:4] E-Coloさんは書きました : > おお先生、あああ先生 > > ありがとうございます。G-だと認識しています。 > DNAse処理にはCaが必要とのことで、1 mM CaCl2を加えていますので、EDTAとの共存はできなさそうに思いますが、おお先生はDNAse使われていないということでしょうか。 プラスミド精製を念頭に置いてました。EDTA、リゾチーム処理をして（おそらくドロドロというかある意味プリンプリンな感じになるから）、そのあとにDNaseとEDTAより少し多めのCaを入れたらいいと思うけど。あと、リゾチーム処理の前に凍結融解するとより効果があると思う。 > > Triton X-100を1%、DNase、Lysozymeで理屈的には溶菌しそうな気がしています。 そうでしょうね。それで問題がなければそうすればいいと思いますが、それで悩んでいるのでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.11919-4 - 2023/11/15 (水) 11:24:16 - E-Colo おお先生、あああ先生 ありがとうございます。G-だと認識しています。 DNAse処理にはCaが必要とのことで、1 mM CaCl2を加えていますので、EDTAとの共存はできなさそうに思いますが、おお先生はDNAse使われていないということでしょうか。 Triton X-100を1%、DNase、Lysozymeで理屈的には溶菌しそうな気がしています。

(無題) 削除/引用 No.11919-3 - 2023/11/15 (水) 11:07:57 - あああ 経験的には必須ではないですが、リゾチームの至適温度50℃に対して溶菌操作は大体４℃なのも相まってあまり効率は良くないかなと思ってます。 （小スケールや数時間〜O/N でRotateするなら単体でも行けそうですが） 一応cytiviaでも界面活性剤入りを一般的なプロトコルとして紹介しています。 https://www.cytivalifesciences.co.jp/technologies/protein_preparation/lysis.html

(無題) 削除/引用 No.11919-2 - 2023/11/15 (水) 09:48:43 - おお Lysozyme is a single chain protein with a MW of 14.3 kD. It hydrolyzes β(1-4)-linkages between N-acetylmuraminic acid and N-acetyl-D-glucosamine residues in peptidoglycans and between N-acetyl-D-glucosamine residues in chitodextrin. Gram-positive cells are quite susceptible to this hydrolysis as their cell walls have a high proportion of peptidoglycan. Gram-negative bacteria are less susceptible due to the presence of an outer membrane and a lower proportion of peptidoglycan. However, these cells may be hydrolyzed more easily in the presence of EDTA that chelates metal ions in the outer bacterial membrane. https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-lysis-and-extraction/lysing-enzymes Gram-positiveとGram-negativeで違いますがそれは意識してますか？Gram-negativeでもEDTAがあると効きがいいらしいです。確かに大腸菌はEDTA存在下でデタージェントなしで使いますね（デタージェントを使うプロトコールもあったような気がする）。確立したプロトコールがあるのになぜ困惑しているのか不思議ですが。。。

リゾチームでの溶菌には界面活性剤は必要ですか 削除/引用 No.11919-1 - 2023/11/15 (水) 09:35:35 - E-Colo リゾチームでの溶菌には界面活性剤は必要ですか？ 細胞壁があるので、外膜を溶かす目的で界面活性剤があった方が、その後のリゾチームが効きやすくなるというのは想像できますが、リゾチームだけのプロトコルが結構あり、困惑しています。

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