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(無題) 削除/引用 No.11909-18 - 2023/11/11 (土) 17:02:13 - BL21 皆様 ありがとうございます。 37度一晩培養によりタンパク質、誘導されていました。 30度で全く誘導されていなかったので温度が重要そうです。 とにかく、プラスミドがただしそうでよかったです。制限酵素カットはしてみますが。 これから可溶性画分に回収される温度と時間をを見つけていこうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11909-17 - 2023/11/10 (金) 16:22:54 - BL21 皆様 ありがとうございます。 プラスミドはaddgeneから届いたものを制限酵素チェックせず、そのままChampioBL21に形質転換しました。コロニーは拾っています。 ただ、制限酵素チェックはしていませんので、確認することといたします。 また、株を変えるというのは経験に基づかれたコメントですので、とても助かります。 プラスミドそのものがあやしいので、封入体に行こうが関係なく、まず発現するはず、という条件で誘導してみて、SDS-PAGEとウエスタンをしてみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11909-16 - 2023/11/10 (金) 11:46:37 - ああ 実際のところタンパク質によって発現に適した温度も発現量(しやすさ)も違うので本来であれば条件検討（温度やIPTG濃度）をするのがいいと思いますが… 高温＆高IPTG濃度で早く大量に発現させてもフォールディング失敗して不溶化することありますし、高分子量タンパクだと低温＆長時間（20℃, 24hr　など）のほうが収量いいこともあるので。 まあ手っ取り早いのは高効率の菌種に変えるか発現しやすいTagに変更することでしょうね

(無題) 削除/引用 No.11909-15 - 2023/11/10 (金) 11:01:12 - が 私もシンプルに株を変えるに、一票。

(無題) 削除/引用 No.11909-14 - 2023/11/10 (金) 10:49:05 - T-2 形質転換後にシングルコロニーを拾ってますか？

(無題) 削除/引用 No.11909-13 - 2023/11/10 (金) 05:15:46 - たこ あらかた書き尽くされてしまっているのですが。。。 同じような状況になってRosetta(DE3)pLysSに変えたところ、しっかりとCBBで発現が見えたことがあります。 別にcodon usageはそんなに問題ないはずの配列でしたが。 可能なら株変えてみてはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.11909-11 - 2023/11/10 (金) 02:24:11 - おお ＞total cell lysateでは47 kDaがぼこっと出ると期待したのですが、 こういう発現系はCBB染色で確認が難しいぐらいしか発現しないことはたびたびあります。WBするか、だまされたと思って一度精製してみてください。

(無題) 削除/引用 No.11909-10 - 2023/11/09 (木) 22:42:22 - G25 宿主ベクター系に間違いがないなら、誘導条件によって発現量の増減はあっても、発現したり全く発現しなかったりというのは考えにくい。 購入したプラスミド、というか形質転換体からretrieveしたプラスミドの検証はしましたか。少なくとも制限酵素消化パターンなんかで。極端な話、中身が別物と入れ替わっている場合もあります。制限消化パターンに矛盾がなくても変異によって発現しなくなっているかも。その疑いが出てきたらシークエンスをみる必要も出てきます。 Addgeneにデポされているコンストラクトならパフォーマンスの検証はされているはずなので、記載情報をもう一度よく確認し、場合によって原著者あるいはは寄託者に問い合わせるというのも選択肢です。元々、発現量の乏しいコンストラクトかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11909-9 - 2023/11/09 (木) 20:53:57 - BL21 皆様、ありがとうございます。 すみません、不十分な情報でした。 Champion21という株で、BL21(DE3)由来です。 pET15はリーキーな発現を抑えられるような工夫がされてるものとして売られているようです。 37度で培養すれば確実に発現するのか、懐疑的に感じています。

(無題) 削除/引用 No.11909-8 - 2023/11/09 (木) 20:36:42 - あああ まさかそこまで知らないことはないだろうと私は敢えて触れなかったのに、先に全部答えを書かれてしまった・・・

(無題) 削除/引用 No.11909-7 - 2023/11/09 (木) 18:34:25 - 774R DE3を使ってるか確認して、もしそうだったなら少しずつ情報を与え、本人が「あっ！」って気付く瞬間を演出するつもりだったのに、先に全部答えを書かれてしまった・・・

(無題) 削除/引用 No.11909-6 - 2023/11/09 (木) 17:28:12 - G25 基底発現もなんも、一般的もなんも、T7 RNA polが存在しなきゃ発現しないよ。

(無題) 削除/引用 No.11909-5 - 2023/11/09 (木) 17:14:09 - のなめ 発現しにくいタンパク質の可能性は大いにあるので、大腸菌を基底発現を抑える株に変えてみるとかはどうでしょう。 あと、pETベクターでしたら、溶原化株であるBL21(DE3)などを用いるのが一般的ですが、わざわざBL21をチョイスした理由等はありますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11909-4 - 2023/11/09 (木) 17:08:51 - G25 BL21(DE3)じゃなくて本当にBL21ですか。 だったらT7プロモータが動かなくて当然ですけど。 T7 プロモータからの転写を行うのはT7 RNA polです。 T7 RNA polはBL21(DE3)のゲノムに組込まれているlambdaDE3 プロファージ上にありlacプロモータ支配下にある遺伝子から発現します。これがIPTGによって誘導されます。 つまりDE3がなければpET15は発現誘導されません。

(無題) 削除/引用 No.11909-3 - 2023/11/09 (木) 17:08:02 - 774R BL21 (DE3)とかじゃなく、ただのBL21ですか？

(無題) 削除/引用 No.11909-2 - 2023/11/09 (木) 16:52:49 - あああ 単に、発現しない（しにくい）タンパク質の良くある話と思いました。試薬等が心配なら、pET15ベクターに何かGFPとかを入れて発現するかコントロールで試せばいいです。コンストラクトが心配ならしーけんしんぐに出したらいいと思います。私なら、試薬とコンストラクトに間違いがなければ、タグなしかタグを変えたのに乗り換えます。発現しないのを発現させるのは大変です。

タンパク質が誘導されない 削除/引用 No.11909-1 - 2023/11/09 (木) 16:47:01 - BL21 T7lacプロモーターを持つpET15ベクターにあるGST-His-Xをクローニングされたプラスミドをアドジーンから購入しましたが、これをBL21に形質転換し、増えてきたところで30度に移行し、アンピシリンを加えた100 ml LB倍地中で1 mM IPTGで６時間誘導をかけたのですが、total cell lysateでは47 kDaがぼこっと出ると期待したのですが、まったくIPTGなしと変わりませんでした。 total cell lysateでは1x SDS sample buffer中（Laemlli buffer）で可溶化し、ソニケーションで破砕しています。 IPTGは購入したばかりで、別のタンパク質の誘導に使ったことがあるので、問題ないはずです。 どこに躓いたのか、改善点等ありますでしょうか？ 37度にすれば変わるのか、オーバーナイトで誘導されるか。 まずはプラスミドがそもそもワークするかの確認が必須だと思いますので、37度、オーバーナイト、1 mM IPTGで行おうと思いますが、それでもダメな場合、やはりプラスミドがおかしいことを疑うべきでしょうか？ 初歩的な質問で恐縮していますが、よろしくお願いいたします。

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