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(無題) 削除/引用 No.11907-9 - 2023/11/14 (火) 02:33:29 - おお だいたい実験の様子がわかったような気がします。 ノンスぺのバンドがCBBもしくは銀染色で検出されて特異的なバンドがあるかどうかわからないということでしょうか。 この場合いくつかの可能性を考えないといけないかもしれません。 ＊使用したIPのコンディションでは結合したタンパクはかなり外れてしまっている。 ＊ノンスぺに紛れてどれが特異的なものかわからない。 後者の場合は先に述べたようなノンスぺの除去を考えるべきかと思います。さらにアイデアを追加すると、Tandem affinity purification (TAP)とかよくやられていたと思います。もしこれができないとしても、V5抗体でIPしてV5ペプチドで溶出してV5ペプチドを除いてからもう一度V5抗体でIPしてもビーズにつくノンスぺはかなり減ると思います。たんにV5ペプチドで溶出するだけでも、非特異的結合は溶出しない（しにくい）のでここで淘汰できるものも多いと思います。 前者のばあいIPの条件をもっと緩くしないといけないかもしれませんが、たとえば既知の結合タンパクは同様の条件で検出できますか？

(無題) 削除/引用 No.11907-8 - 2023/11/13 (月) 16:42:50 - おお >[Re:5] CD7さんは書きました : > ＞T7タグを入れたタンパクは検出できてますか？ > > V5タグは検出されます。 > > 75000Gでもいいですかね？100000の方がいいんですか？ 75000ではだめと言う話でも無いと思いますが、、、計算方法は確認しないといけないので具体的数字は書けませんが、時間を長くすると、100000に近い効果が得られると言う見方もあります。

(無題) 削除/引用 No.11907-7 - 2023/11/13 (月) 11:51:24 - G25 >前回は、V5 tagのみと、V5融合たんぱく質を比較したところ、非特異的バンドが多数見えて、目的のたんぱく質を同定できませんでした。 これはV5のみでもV5 fusionでも同様な非特異的バンドが多数見えて、bateに特異的に結合しているタンパク質が見えてこないということですよね。 つまりV5 tagのみでも非特異的にくっついてくるタンパク質がたくさんあるということですよね。 基本的にはおおさんの最初のレスにある対処法はすべて試してみるのがいいですが、 V5 tagのみでもくっついてくるタンパク質はつまりは担体自体にくっついてくるものですから、プレクリアで予め担体に吸着して除去しておくのが良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.11907-6 - 2023/11/13 (月) 11:17:39 - qq 超遠心で抽出液から粒子を除去するのもありかもしれませんが、、、 ノンスぺを減らすのであれば、Dynabeadsを使うのが良いのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11907-5 - 2023/11/12 (日) 23:11:03 - CD7 ＞T7タグを入れたタンパクは検出できてますか？ V5タグは検出されます。 75000Gでもいいですかね？100000の方がいいんですか？

(無題) 削除/引用 No.11907-4 - 2023/11/10 (金) 14:19:00 - おお >[Re:3] CD7さんは書きました : > つまり、今の状態でも、SILACではないのですが、半定量のMassでtagのみと比較して、新規のたんぱく質を同定するということでしょうか。 > > 今は、ラダー状のバンドが見えて、ほぼバンドが一致している印象です。 そんな状態でもMASSでけっかをだしているのを見た事はあります。ベストでは無いにしろノンスペとして付かないものであれば差が見れる。 > > １０００００G以上で遠心というのは初めて聞きました。それでいいのですか？確かに微小顆粒が浮遊している気が少ししています。 https://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/4/pdb.prot4536.abstract https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/documents/661/766/immunopreciptroubleshoot.pdf Spin the lysate at 100,000g for 30 minutes before adding the antibody to remove insoluble proteins, membrane fragments, etc. T7タグを入れたタンパクは検出できてますか？

(無題) 削除/引用 No.11907-3 - 2023/11/10 (金) 12:33:44 - CD7 つまり、今の状態でも、SILACではないのですが、半定量のMassでtagのみと比較して、新規のたんぱく質を同定するということでしょうか。 今は、ラダー状のバンドが見えて、ほぼバンドが一致している印象です。 １０００００G以上で遠心というのは初めて聞きました。それでいいのですか？確かに微小顆粒が浮遊している気が少ししています。

(無題) 削除/引用 No.11907-2 - 2023/11/10 (金) 02:16:07 - おお Washは転倒混和でピペットとか使ったことはないです。そんなんで変わるもんかと思うのですが。 新規と書いてますが、目的のたんぱく質とも言ってます。具体的に何か特定のタンパク質を検出したいということでしょうか？なら検出というのはWBでしょうか？ ノンスぺの減らし方はいろいろ考えられますが、 まずそのタンパクの局在などの情報から、エンリッチメントをする。例えば膜タンパクなら膜だけのフラクションを回収する。あるいはもっと生化学的な手法もあるとおもう。 IP、Washのバッファーを工夫する。 デタージェントの種類、濃度、混合など。RIPA bufferはかなりクリーンになるイメージはありますが、タンパク相互作用に悪影響を及ぼすことも多いけど、一度試してみてもいいかもしれません。 塩濃度を工夫してみる。 若干高めの塩濃度がベターだったりすることがある（３００ｍM　NaClとか）。また弱いカオトロピック作用のあるLiCl（３００ｍMぐらい）をつかう。強い変性作用を伴うようなものでも微量加えるというのも手としてはある。 バッファーｐHを工夫してみる。 ビーズのブロッキング。 どの程度効果があるかわからないけど、そうしている人はいる。BSAでブロッキングのもよく聞くが、タンパク性のものを入れたくないならPVPなども選択肢 IPの前にプレクリアーをする。 ビーズ（同様の支持体だけのビーズでもいい）を入れてしばらく転倒混和してビーズを除いてから、IPにうつる。 サンプルを１０００００から１５００００ｇで遠心して微細な粒子状になっているようなものなどを除く。 上記両方やってもいい。 サンプルにクロスリンク処理をして結合しているだろうタンパクをコバレントな結合にしてからIPする。このときLysis bufferやWash bufferは厳しい条件のもの（RIPA bufferとか）でも離れないのでバックグランドをかなり減らせる。クロスリンクしたものはその結合したタンパクの分子量を足したところにバンドが現れるけど、DTTなどで外せるようなものもある。 ところで、バックグランドがたくさんあるある意味緩い条件でものが検出できなかったのに厳しい条件でやって望みがあるものかと少し不思議に思います。おっかなびっくり洗ってものが検出できなかったのに、それよりもっと洗っても、もともとないものが検出できると思えませが、、、

免疫沈降でビーズをどうwashするか 削除/引用 No.11907-1 - 2023/11/09 (木) 10:59:46 - CD7 共免疫沈降で、新規結合たんぱく質の同定を目指しています。 前回は、V5 tagのみと、V5融合たんぱく質を比較したところ、非特異的バンドが多数見えて、目的のたんぱく質を同定できませんでした。 bufferの組成に加えて、ビーズをどうwashするかが重要だと思うのですが、どれくらいの強さでピペッティングしてwashしていますか。 前回はおっかなびっくり新規たんぱく質が離れないようにやさしくwashをしていました。

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