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(無題) 削除/引用 No.11904-14 - 2023/11/09 (木) 11:44:40 - らら 成功している人も、私と同属の菌株のシーケンスをしていました。。 もう一度、pcr増幅からやり直してそれでもダメだったら、成功している人と一緒にやるか、提案していただいたプライマーでやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11904-13 - 2023/11/09 (木) 00:16:13 - SYBR+master >[Re:12] ららさんは書きました : > 明日、成功してる同研究室の人に、なんの菌株だったか聞いてみます。 その方が良いですね。 あと書き忘れたけど、 >M13等のprimerでsequenceします。その場合、primer部分の問題も解明できると思いますよ。 direct sequenceを行っているのであれば、 926f;5'-AAACTYAAAKGAATTGACGG -3' とか 1114F;5'-GCAACGAGCGCAACCC-3' でsequenceすれば、primer siteまで読めるんじゃ無いかな。 微生物のPCR用primerなら、これが参考になるかもしれません ttps://nria.fra.affrc.go.jp/sindan/pcr/16SrRNA_list.pdf

(無題) 削除/引用 No.11904-12 - 2023/11/09 (木) 00:04:35 - らら 明日、成功してる同研究室の人に、なんの菌株だったか聞いてみます。

(無題) 削除/引用 No.11904-11 - 2023/11/09 (木) 00:00:39 - SYBR+master >[Re:10] ららさんは書きました : > Big Dyeも貴重なものですし、シーケンス解析にもお金がかかりますし、やみくもに色々試してもなぁと思い、ここで質問させていただきました。なら少しでも節約するためにBig Dyeを希釈して使えよって話なんですが。。 Big Dyeに付いては既に特許も切れているし、希釈系で対応できるの(max 64倍のデータもあるけど)ですが、私は20-30倍くらいで使用しています。 希釈用の5xbufferが売られていますけど、自作できるのですが不安なら購入して下さい。ってか、今普通にBig Dyeに付属されていなかったっけ？ > もし成功している同研究室の人も、私と同属の菌株を調べてたら話は変わってきますか？ 対象菌体が変われば、同じ事起きますね。単なるPCRとSanger sequenceの事なので。

(無題) 削除/引用 No.11904-10 - 2023/11/08 (水) 23:48:33 - らら 菌株名が載った投稿は消しました。ありがとうございます。 Big Dyeも貴重なものですし、シーケンス解析にもお金がかかりますし、やみくもに色々試してもなぁと思い、ここで質問させていただきました。なら少しでも節約するためにBig Dyeを希釈して使えよって話なんですが。。 曖昧な質問に丁寧に答えてくださり、本当にありがとうございます。。すっごく悩んでいるので、とても嬉しいです。。 もし成功している同研究室の人も、私と同属の菌株を調べてたら話は変わってきますか？

(無題) 削除/引用 No.11904-9 - 2023/11/08 (水) 23:48:06 - SYBR master >[Re:8] SYBR masterさんは書きました : > これ、多分重要な情報過ぎるので、この投稿消した方が良いです。なので、こちらも引用は見えない用意しますね。 投稿消してくれてありがとう。その情報だけで、研究の場所が数カ所に限定できてしまいますので。 貴方の指導教官がどの様な人かは解らないですが、ボクなら、「1492r」のデータについては、クロマトピークを見ながら、検討します。もしできない人なら個人的には「あほう」なんだろうと思うだけです。 あと個人的に、高いクロマトピークがほしいなら、direct sequenceでは無く、vectorに入れて(面倒なのはよく解っているけど）、M13等のprimerでsequenceします。その場合、primer部分の問題も解明できると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.11904-8 - 2023/11/08 (水) 23:22:23 - SYBR master >[Re:6] ららさんは書きました : > 1サンプルにBig Dyeを1μ使ってます。 お金持ちですね(はっきり言って嫌みですｗ) > 調べている細菌は、++++++++だろうと予想しています。 これ、多分重要な情報過ぎるので、この投稿消した方が良いです。なので、こちらも引用は見えない用意しますね。 > 同研究室の別の人も同じプライマーおよび方法でDNA抽出〜シーケンスをしていますが、私のはいつも読めてない状況です。 先にも書きましたが、primerと産物の配列が、そこだけ合わないだけです。

(無題) 削除/引用 No.11904-7 - 2023/11/08 (水) 23:18:14 - SYBR master >[Re:3] ららさんは書きました : > シーケンス前のpcr増幅で、27f.1492rを使ってますが、シーケンスでは読めなくなるんですか？ PCRで増やしたときの酵素が、KODやPrimSTARmの様のpfu系酵素(3'-5' exonuxlease活性を持つ物）だと末端が間違っていていもPCRは、普通に走るんです。これは解りますか？ でもPCR産物のdirect sequenceの時は、Taq系の酵素(厳密には違うけど、3'-5' exonuxlease活性を持たない酵素）を使用するので、末端の配列が異なるとPCRを利用したsequenceはできなくなったり、走りにくくなります。 1492ｒで一般的な配列は 5'-GGYTACCTTGTTACGACTT-3' ですけど、3末のTが一個変異していた場合PCRは走っても、シークエンス、特にsanger sequenceのクロマトピークは低くなります。 個人的にはWhole genomeのsequenceがかなり溜まってきているので、いい加減16s rRNAのPCR用配列を見直した方が良いとは思うんですけどね(数が多すぎて自分ではやりたくないんですけど）。

(無題) 削除/引用 No.11904-5 - 2023/11/08 (水) 22:53:18 - SYBR master >[Re:3] ららさんは書きました : > シーケンス前のpcr増幅で、27f.1492rを使ってますが、シーケンスでは読めなくなるんですか？ 今手持ちのでデータでは確認できないのですが、微生物の16s RNA用の1492rって、僕がしっているだけで6種類くらい有るし、その中では複合塩基持っている物もあるので、貴方の示す1492rの配列示してくれないと、正確な回答はできないです。 因みに、16s rRNA用のPCRは少しくらい間違っていてもPCR走るように設定されています。なので、メタゲノム系のPCRだと、PCR中に組み変わったPCR産物頻繁に作成されます。

(無題) 削除/引用 No.11904-4 - 2023/11/08 (水) 22:43:27 - SYBR master >[Re:1] ららさんは書きました : > シーケンスで27f、1492r、357f、517rのプライマーを使用していますが、1492rだけ読めません。 因みに、バックグラウンドの情報が少なすぎて、これは此所でも普通は放置される質問なのですが、もう少し詳細な情報を与えてくれないと、回答できませんよ。

(無題) 削除/引用 No.11904-3 - 2023/11/08 (水) 22:43:15 - らら シーケンス前のpcr増幅で、27f.1492rを使ってますが、シーケンスでは読めなくなるんですか？

(無題) 削除/引用 No.11904-2 - 2023/11/08 (水) 22:38:47 - SYBR master >[Re:1] ららさんは書きました : > シーケンスで27f、1492r、357f、517rのプライマーを使用していますが、1492rだけ読めません。ピークが低いです。プライマーが原因かと思ったのですが、違う人は同じプライマーを使って全て読めています。 多分、数字から想像するに微生物の16s rRNAの配列だと思うんだけど、多分1492Rだけ、末端の配列の1-2merが貴方が読みたい物と合わないんだと思います。

シーケンス　特定のプライマーだけ読めない 削除/引用 No.11904-1 - 2023/11/08 (水) 21:48:49 - らら シーケンスで27f、1492r、357f、517rのプライマーを使用していますが、1492rだけ読めません。ピークが低いです。プライマーが原因かと思ったのですが、違う人は同じプライマーを使って全て読めています。

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