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(無題) 削除/引用 No.11895-7 - 2023/11/08 (水) 12:49:53 - Cas9 ＞気になるのはスクリーニングですから、結局特定の形質の細胞を集めてきてからその細胞で発現しているｇRNAを特定しないといけないですよね。Transientでゲノムが編集されたりしても、ｇRNAをコードする配列がゲノムに残ってなかったらスクリーニングになりますか？ これは気になっていたのですが、いつの間にか頭から抜けていました。 ウイルスでのTransientの発現でも、ゲノムに組み込まれている可能性を考えているうちに。蛍光の消退は、メチル化等によるのかなと。 現行では、10%位ですので10倍の細胞量を用意する必要があります。 選別は、基本的にはFACSを使いますよね？大規模に陽性細胞だけ取ろうと思うとそれだけでも、かなり大変ですね。

(無題) 削除/引用 No.11895-6 - 2023/11/07 (火) 09:04:57 - 独り言 Cas9スクリーニングを過信し過ぎでは。 やれば、必ず結果がでるほと、甘いものではありません。 ライブラリーによりますが、1000万細胞ぐらいで、ライブラリーのvaraetyを確保しつつ、目的細胞を濃縮しなければ、なりません。 スクリーニングした論文を読むと、簡単に新しい遺伝子が単利できるかのように思われますが、おそらくその陰で、結果がでずに論文にならないスクリーニングの結果は、数多の数だと。どんな研究でもそうであるように。 なので、感染効率が悪いのであれば、1億個でも10億個でも、初期の感染させる細胞増やして、gRNAが入った安定株を必要数以上用意する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.11895-5 - 2023/11/07 (火) 02:50:44 - おお ＞stableの細胞ができる割合が少なかったとしても、Transientな感染の段階で蛍光を発している細胞をセレクションすれば十分なのかな ＞Cas9システムはそれほど強力なツールだと想像しているので 気になるのはスクリーニングですから、結局特定の形質の細胞を集めてきてからその細胞で発現しているｇRNAを特定しないといけないですよね。Transientでゲノムが編集されたりしても、ｇRNAをコードする配列がゲノムに残ってなかったらスクリーニングになりますか？

(無題) 削除/引用 No.11895-4 - 2023/11/05 (日) 20:02:19 - asan >stableの細胞ができる割合が少なかったとしても、Transientな感染の段階で蛍光を発している細胞をセレクションすれば十分なのかなと考えているのですが、正しいでしょうか（質問内容）。 厳密には正しくないですが、発現しすぎているよりは理論上はましです。 極端な感染状態でバルクスクリーニングをやるとライブラリーのdistributionが偏るリスクが高いです。 ＞Cas9スクリーニングを予定していますが、実験系の都合上、感染効率が悪い細胞を使わざるを得ません。一時的に蛍光を発する細胞数は少なくないのですが、ゲノムにインテグレートされる割合が少ないのか、1週間で蛍光が減弱する細胞がほとんどです。 これはCas9システムとは無関係な細胞固有の問題なので、横着せずにまずはウイルスの感染条件に関して一つ一つ丁寧に解決していくべきだと思います。

(無題) 削除/引用 No.11895-3 - 2023/11/05 (日) 19:56:57 - おお 因みにポリブレンの代替として、レンチブラストとか確か血球系ならレトロネクチンとかありますし他にもあるかもしれませんので調べて、できればためしてみるといいのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.11895-2 - 2023/11/05 (日) 19:52:34 - おお 元々レンチなど使わずにtransient に発現させてクローンを拾いターゲットの遺伝子が改変されているか確認して細胞株を樹立したとしていたと思います。 すくリーニングなら一つ一つ確認してからとはいきませんが、スクリーニングで改変されてない細胞が引っ掛からなければ、系が成り立つ可能性はそこそこあると思いますが。。。 おそらく、gRNAライブラリーを蛍光タンパクと共にレンチで感染しているのでしょうけど、蛍光が光らなくなるというより、gRNAの発現が維持されているか、どの程度インテグレートされているかを見る方が直接的なんじゃないかと思いますが。それを見た上で効率が悪いならMOIを上げるとか判断をしやすいと思うし。

Cas9スクリーニングでの問題点の解決方法 削除/引用 No.11895-1 - 2023/11/05 (日) 15:53:04 - Cas9 実は以前似たような相談させていただいたのですが、どうしても解決しないので再度質問させていただきます。 Cas9スクリーニングを予定していますが、実験系の都合上、感染効率が悪い細胞を使わざるを得ません。一時的に蛍光を発する細胞数は少なくないのですが、ゲノムにインテグレートされる割合が少ないのか、1週間で蛍光が減弱する細胞がほとんどです。 スクリーニングを行うために、FACSで、2-3回セレクションを行う予定なので、全体の工程には3週間ほどかかる予定です。 stableの細胞ができる割合が少なかったとしても、Transientな感染の段階で蛍光を発している細胞をセレクションすれば十分なのかなと考えているのですが、正しいでしょうか（質問内容）。Cas9システムはそれほど強力なツールだと想像しているのですが。 細胞はすでにCas9を発現する細胞を準備しています。薬剤セレクションは、試行錯誤したのですが、理由があって、諦めました。

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