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(無題) 削除/引用 No.11889-4 - 2023/11/03 (金) 00:17:05 - おお read-throughはタンデムなら起こる可能性はあるかもですね。プラスミドなら一周して直前の遺伝子が読まれたりとかも可能性があるので、ルシフェラーゼのようなプロモーターなどのリポーター用プラスミドは調べたいエンハンサーープロモーターの直前にPolyA siteを置いたりしていますね。ただ示されたプラスミドの場合李コンビネーションで直鎖になるようなのでCAGからぐるっと回ってということでもないですし、TRE3Gからのread-throughは、ほかはConstitutiveに発現させるためなので考える必要もないでしょうし。 実際のコンストラクトではいろいろ可能性は考えますが、それを検証したうえで作るまでの事はしないと思います。ケアフルな人であれば両方の向きで作ってどちらがうまくワークするかとを見ている可能性はありますけど。そういうのも論文で一言でも触れていれば情報として有用なのかもしれませんが、そこまでしないこともたぶん多いと思います。昔ならシーケンスデーターからこの部分に制限酵素でライゲーションしたとか大体わかることもあるので、制限酵素をつかったための向きの制約かどうかはわからなくもないですが、今はシームレスでつなげてしまえるので判断つかないかもしれません。 でTRE3Gはタカラで単独のプラスミドがありますので、上流に反対方向のプロモーターがクリティカルというほどではないと思います。ただ近くにCMVエンハンサーがあるので、その影響でTRE3Gからの発現が強くなるという期待は持てるかもしれませんね。と書くと、エンハンサーは位置はあまり関係ないからという突っ込みもあるかもしれませんが。 といろいろと思うことを書き連ねてみました。

(無題) 削除/引用 No.11889-3 - 2023/11/02 (木) 10:54:03 - G25 transcriptional interference (TI) を避けるためかも。 TIが起こるconfigurationはいろいろあるけれど、 tandem な遺伝子の上流側遺伝子の転写が起こると下流側の遺伝子の転写が抑制せれるバターンが相当しそうだ。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3023640/ Fig 1のBのパターン あるいはtandem に遺伝子を並べると、上流側遺伝子の転写のread-throughによって下流の遺伝子のleaky expressionが起こる可能性があるから。

(無題) 削除/引用 No.11889-2 - 2023/11/01 (水) 23:02:02 - SYBR master 真核の発現系については、20年くらい前(マジで、古いな)までの知識で止まっているんだけど、たしか一部のptomoterは何かよく解らないけど、両方向に発現が起きるのでpromoter挟んで(head to head, HtoHと呼んでいて気がする)、遺伝子を配置すると両方の遺伝子が発現するとされていた記憶があります。 ヒトやマウスの全genomeが決まりだした頃、Cellだったかのreviewで、genome中の遺伝子配置で免疫に関わる遺伝子が何故かこのHtoHで配置されていると言うのを呼んだ記憶があって、へ〜、と思ったのが20年くらい前です。 今ならもっと細かく詳細わかって居るかもしれないけど、何せ転写関係は20年くらい前から分野としては廃れたので現在でも細かく解っていないかもしれません。もし進展があるのなら教えて欲しいです。Referenceくれれば読みますので。 因みにトピ主のいう、 >「→ →」のように同じ鎖で隣り合わせ なら、たぶんpromoterは個々の遺伝子で必要になりますよ。

プラスミドで遺伝子発現 削除/引用 No.11889-1 - 2023/11/01 (水) 13:58:04 - プラスミドで発現 モレキュラー実験に詳しい研究者の方、ご教示をお願い致します。 プラスミドによる過剰発現実験を計画する時ってドナープラスミドに適切なプロモーターと発現させたい例えばGFPみたいな遺伝子を乗せて、トランスフェクションで細胞内に入れて機能させるのですが... 例えばAddgeneのこのプラスミド addgene-plasmid-52343 を見た時に発現させたいTREプロモーターで発現するGFPとCAGプロモーターで発現するTET-On_3Gが「← →」のように相補鎖で3'側と3'側がくっついていますよね？ これってなぜ「→ →」のように同じ鎖で隣り合わせではなく、「← →」のように相補鎖お尻を合わせた形にしているのですか？なにか発現上の利点があるのですか？それともプラスミド作製上で都合がいいのでしょうか？

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