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glucose 削除/引用 No.11888-11 - 2023/11/04 (土) 14:04:04 - Giji glucose入りLBだと、発色悪いはず。 αコンプリメンテーションのペプチド配列は結構種類があり、物によっては安定性が低いはず。 （普通のpBluescriptであれば、あまり考える必要ないけど、、、。） 自分でαコンプリメンテーションの配列を解析したら、結構違うことがわかり、興味深かった。

(無題) 削除/引用 No.11888-10 - 2023/11/02 (木) 20:34:05 - SYBR master >[Re:9] G25さんは書きました : > 同じLacI^qでもXL1-BlueはJM109よりblueの発色が良いのが売りの一つじゃったが、なぜそうなのかはわかっていないっていうんじゃなかったかのう。 > むしろlacIよりもF'上のΔ(lacZ)M15（LacZomegaを含む）の発現量のバリアントのような気がしますのじゃ。 すいませんｗもう普通に書いて下さい。年寄り扱いしてゴメンナサイ。

(無題) 削除/引用 No.11888-9 - 2023/11/02 (木) 20:29:45 - G25 同じLacI^qでもXL1-BlueはJM109よりblueの発色が良いのが売りの一つじゃったが、なぜそうなのかはわかっていないっていうんじゃなかったかのう。 むしろlacIよりもF'上のΔ(lacZ)M15（LacZomegaを含む）の発現量のバリアントのような気がしますのじゃ。

(無題) 削除/引用 No.11888-8 - 2023/11/02 (木) 19:32:04 - SYBR master >[Re:6] G25さんは書きました : > DH5alphaのlacIはwildtypeではなかったかのう。 そうなんですよね、私もそう記憶していたんですけど、20年以上前にLB plateでのカラーセレクションでは入れなくても十分に発現するので、最初に見たときは驚いた記憶があります。なのでそれ以降は、X-galだけ入れてIPTG入れないでLB plate作成しており、記載漏れで壊れているか、wild typeだと考えているよりLacIの発現が弱いため、トリプトンに混在しているラクトースで解除できるのかもしれません。 > JM109などが有するlacL^qが高発現変異でlacオペロン発現を強く抑制し発現モレが起こりにくいが、IPTGなどのinducerを加えると解除できるので、on/offの切れ味がいいということではなかったかのう。 XL1-BlueはLacIのpromoter強化しているのは記憶があったんですけど、JM109もでしたか。もしかしたらpromoter強化が、IPTGが必須かどうかの鍵なのかもしれませんね。 >[Re:7] のなめさんは書きました : > 参考まで... 記載ありがとう。

(無題) 削除/引用 No.11888-7 - 2023/11/02 (木) 10:27:23 - のなめ 参考まで... DH5α：F-, Φ80dlacZ�儁15, �凵ilacZYA-argF）U169, hsdR17（rk- mk+）, recA1, endA1, relA1, deoR, supE44, thi-1, gyrA96, λ- JM109：F’ [traD36, proAB, lac Ｉq, lacZ�儁15], �凵ilac-proAB）, hsdR17（rk- mk+）, recA1, endA1, relA1, supE44, thi-1, gyrA96, e14-(mcrA-) XL1-Blue：hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, supE44, relA1, lac[F’, proAB, lac Ｉq Z�儁15, Tn10（tetr）]

(無題) 削除/引用 No.11888-6 - 2023/11/02 (木) 09:30:37 - G25 DH5alphaのlacIはwildtypeではなかったかのう。 JM109などが有するlacL^qが高発現変異でlacオペロン発現を強く抑制し発現モレが起こりにくいが、IPTGなどのinducerを加えると解除できるので、on/offの切れ味がいいということではなかったかのう。

(無題) 削除/引用 No.11888-5 - 2023/11/01 (水) 22:28:29 - SYBR master >[Re:2] ああさんは書きました : >βガラクトシダーゼはラクトースオペロンの活性化によって発現する遺伝子で、通常はX-galとIPTG（ラクトースに似た化合物）を加えてセレクションを行います。なのでラクトースなしのLB培地では意味がありません 菌株によって異なります。DH5-alpha等は、LacIが壊れているので、IPTGやラクトースが無くても、Lac promoterの誘導は掛かります、と言うか出っぱなしになります。タンパク質の発現系のvectorにLacIを乗せているのはそのためです。pAcGFPなんか、LacI無いのでDH5-alphaに入れただけでGFP発現していますよ 因みに、LB培地には「トリプトン」を必ず入れますけど、これは牛乳のカゼインをトリプシン処理しているので、牛乳由来の「ラクトース」が「必ず」混在しています(混在量はロットごとに異なる）。なので、完全にlac promoter系を止めたいときはglucoseを添加します。以前はBacto社のHPに混在量乗っていたけど、最近は無いみたい。 したがって、おおさんの言っている、 >まあその前に、実験系がよくわからないわ。それと、かなり低いって何に比べてとか基準になるものがあるのかも、 の方が正しい反応ですね。 中途半端な知識だと、色々実験組み立てるの問題ありそうなんだけど大丈夫？

(無題) 削除/引用 No.11888-4 - 2023/11/01 (水) 15:51:34 - のなめ ああさんもおっしゃっているように、ただのLB培地ではβガラクトシダーゼは高発現しません。ラクトースを入れる、あるいはIPTGを入れることにより誘導できます。 ちなみに大腸菌へ導入したプラスミドにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）が乗っている形質転換体を作製したという事でよいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11888-3 - 2023/11/01 (水) 15:46:39 - おお まあその前に、実験系がよくわからないわ。それと、かなり低いって何に比べてとか基準になるものがあるのかも、

(無題) 削除/引用 No.11888-2 - 2023/11/01 (水) 15:08:37 - ああ βガラクトシダーゼはラクトースオペロンの活性化によって発現する遺伝子で、通常はX-galとIPTG（ラクトースに似た化合物）を加えてセレクションを行います なのでラクトースなしのLB培地では意味がありません

青コロニーのβガラクトシダーゼ活性が低い 削除/引用 No.11888-1 - 2023/11/01 (水) 13:31:10 - pommm 実験初心者です． 青白セレクション（X-galを塗布した培地に形質転換体をまき，37°C，24h培養➡４°Cで保存）で濃い青色のコロニーを1 mL LBで培養してβガラクトシダーゼ活性を計るとかなり低いことが多いです． これはよくあることですか．原因はありますか．

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