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(無題) 削除/引用 No.11885-8 - 2023/11/01 (水) 09:32:09 - ど素人 TEさん、おおさん 大変勉強になります。有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.11885-7 - 2023/11/01 (水) 01:05:07 - おお >[Re:3] ど素人さんは書きました : > おおさん > シグナルペプチド-GFPプラスミドをHEK293にトランスフェクションした場合、 > 蛍光顕微鏡で観察すると発現している細胞は緑色に光るものなのでしょうか？ > ほとんど分泌されているので、光らない？ 細胞内でたゆまなく作られているわけですから、方法論は置いといて細胞内で検出できます。分泌タンパクをCell lysateから検出するというのはそれなりにデーターを見ます。 GFPタグではないですけどインシュリン抗体で染めると細胞内で検出されています。 https://www.abcam.com/products/primary-antibodies/insulin-antibody-ab63820.html

(無題) 削除/引用 No.11885-6 - 2023/10/31 (火) 19:56:03 - TE 膜タンパクでSignal-6xHis-FLAG−でいくつかやったことがありますが、基本的に問題なかったですね。ただし、これらのtagが完全に露出しているかどうかはモノによりけりみたいで、anti-His tag抗体, anti-FLAG抗体ともにFACS検出できる場合もあれば、片方だけの場合もありました。また、anti-His tag, anti-FLAGも複数クローン試して、このタンパクの場合はこちらのクローン、あれには別のクローンってこともありました。

(無題) 削除/引用 No.11885-5 - 2023/10/31 (火) 14:43:28 - ど素人 774Rさん、ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.11885-4 - 2023/10/31 (火) 12:38:14 - 774R 非分泌型のものよりは暗くなりますが、分泌前のGFPが細胞内にあるので光りますよ。

(無題) 削除/引用 No.11885-3 - 2023/10/31 (火) 12:32:18 - ど素人 おおさん 素晴らしいご助言有難うございます。 なるほどそのようにすれば良いのですね。 ちなみになのですが、His-tagなしの シグナルペプチド-GFPプラスミドをHEK293にトランスフェクションした場合、 蛍光顕微鏡で観察すると発現している細胞は緑色に光るものなのでしょうか？ ほとんど分泌されているので、光らない？

(無題) 削除/引用 No.11885-2 - 2023/10/30 (月) 23:01:22 - おお 膜付近のチャージでトポロジーが決まるから、電荷の偏ったものを途中に入れるより、c末に入れるのが好まれていると思う。 ポジティブインサイドといわれていて、塩基性のアミノ酸が膜周辺にあるときは、塩基性の方が細胞質側に向くようになっているらしい。どうしてもN末というなら、シグナルペプチドーシグナルペプチダーゼ認識配列とそのC末側5から10アミノ酸−6xHISーGFPという設計にわたしならすると思う。

Signal peptide直後にHis-tag 削除/引用 No.11885-1 - 2023/10/30 (月) 19:27:28 - ど素人 とあるタンパク質（例としてGFPとします）をHEK293に分泌させて、培養液から回収したいです。また、GFPのN末端はHis-tagをつけておきたい。 この場合、例えば EGFRのシグナルペプチド-6xHis-GFP-stop というプラスミドを設計してHEK293にトランスフェクションすれば、 His-tag付きのGFPが培養液にでてくるのでしょうか。 シグナルペプチドの直下に6xHisのような奇妙な配列を入れても、 分泌に影響はない？ ど素人質問ですみません。

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