全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11883-15 - 2023/11/02 (木) 21:35:36 - SYBR master >[Re:14] G25さんは書きました : > 3'末端の一塩基ミスマッチでもPCRが走るとしたら、以下のような原因が考えられます。 これもうひとつ避ける方法有って、今のprptocolはよく知らないけど、qPCRの時は20年くらい前ならprimerの濃度下げるという方法有ったんですよ。Tmって、primer濃度に影響受けるんで(濃度下げるとTmは上がる）。初期の頃のqPCRって、primer濃度をPCRが掛かるかどうか近くまで下げて行うの、ってのが入っていたんですが、最近無いんですかね？ 濃度下げると、１base違いでもPCRで区別できますよ。

(無題) 削除/引用 No.11883-14 - 2023/10/31 (火) 17:34:54 - G25 3'末端の一塩基ミスマッチでもPCRが走るとしたら、以下のような原因が考えられます。 ・プライマーの劣化（保存中に3'末端が削れている） ・input DNAなどに夾雑し持ち込まれるexonucleaseでプライマーが削れる。 ・PCR反応系のtuningが良くない（例えばdNTP濃度が高すぎるなどするとmisincoporationが増加したりmismatchを乗り越えて伸長したりしやすい。cf. error-prune PCR）。 ALDH2のgenotypingは学生実習でもやりますけど、切れ味は悪くない。

(無題) 削除/引用 No.11883-13 - 2023/10/31 (火) 12:30:24 - 774R Taqが１塩基のミスマッチを許すとはいえ、その頻度を考えれば効率的な増幅は起きないでしょう。 ALDH2の１塩基置換を利用したgenotypingも可能です。 https://www.nippongene.com/siyaku/product/educational-kits/isohair-jr/isohair-aldh2.html

(無題) 削除/引用 No.11883-12 - 2023/10/31 (火) 08:33:13 - PCR 皆様ありがとうございます。 質問以上の知識ができて嬉しいです。 私も感覚的には1-2bpくらいの違いなら結構容易に増えてしまうのではないかと感じるため、3'の6bpくらいを増やしたいエクソンに特異的な配列にし、増やしたくないオルタナティブエクソンの混入を防ぐつもりです。 根拠は、6bpなら予想Tm値が1桁℃なので、まあ無理やりアニーリングされてしまう可能性はないだろうと思われるからです。7bb にすると20℃くらいなので、まあ7bpは一応やめておくかという気分になりました。

(無題) 削除/引用 No.11883-11 - 2023/10/31 (火) 07:44:56 - Skeptics >[Re:9] 774Rさんは書きました : > >教科書的にはそうですが、実際は1-2塩基程度の違いだと無視できない程度に増える場合も結構あるので、それを絶対的に考えるのは危険です。 > > Taqでもそうですか？ PCRで複製エラーが生じるということは、少なくとも1塩基の違いについては増えるということの証拠ではないですか？

(無題) 削除/引用 No.11883-10 - 2023/10/31 (火) 05:34:38 - Primer 私はG25さんの説明された話を知っていたので、Taq使いました。PromegaのGoTaqです。

(無題) 削除/引用 No.11883-9 - 2023/10/31 (火) 04:35:53 - 774R >教科書的にはそうですが、実際は1-2塩基程度の違いだと無視できない程度に増える場合も結構あるので、それを絶対的に考えるのは危険です。 Taqでもそうですか？

(無題) 削除/引用 No.11883-8 - 2023/10/31 (火) 03:00:52 - Primer >教科書的にはそうですが、実際は1-2塩基程度の違いだと無視できない程度に増える場合も結構ある 経験あります。私はトピ主とは逆で、そこに未知のエクソンがあると予想してプライマーの3'末端を変えたプライマー群（こういうのdegenarate primersって言うんでしたっけ？）でPCRを行ったのですが、プライマーの3'末に"非"特異的な形での増幅もかなりありました。 こういうのって、オリゴの合成の際に意図しないヌクレオチドもつくことが多少あってそこから増幅されてたりするのでしょうか？（例えば3'末をgで注文したのが、実際には3'末がgが99.1%で、a,t,cのものが0.3%ずつ混じってるとか）オリゴ合成の経験も知識も無くて完全に間違ったことを言ってる気もするですが、この実験結果を得た時に漠然と考えた可能性です。どなたか詳しい方おられないでしょうか？ （上記の数字、正しい塩基が3'末につく可能性が99.1%だとしたら、20bpのプライマーを作ったら99.1％の20乗で、最終的に注文通りのプライマーは85%前後しかなくなるから、やっぱりそんな訳は無いのかな、とも思います。間違ってても怒らずに聞いて頂けたら幸いです）

(無題) 削除/引用 No.11883-7 - 2023/10/29 (日) 20:12:43 - asan ＞3'末端の５塩基の配列が相補的でなくなったらフラグメントは増えないと考えても大丈夫でしょうか。 教科書的にはそうですが、実際は1-2塩基程度の違いだと無視できない程度に増える場合も結構あるので、それを絶対的に考えるのは危険です。

(無題) 削除/引用 No.11883-6 - 2023/10/29 (日) 13:15:47 - PCR G25さま ありがとうございます。qPCR をやるのが目的ですが、まずRT-PCR でシングルバンドが出ることを確認してから使用しますので両方でワークすることが必要です。ですのでご助言をいただき大変助かりました。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11883-5 - 2023/10/28 (土) 18:30:07 - G25 私はPCRの一般論のつもりで書きましたが、 real time PCRをやろうとしていたのですね。 各社のreal time PCR用製品のほとんどではTaqが使われていますね。 まれに他の酵素を使っているものもありますが、3' exo活性のある酵素の 場合はその欠損体が使われているようです（Toyobo KOD　exo(-)のように）。 そういうのを見るとやはり、3'ミスマッチのあるプライマーでアリルやバリアントを区別して検出できることに配慮しているのかもしれません。 https://lifescience.toyobo.co.jp/user_data/selection-02.php real time PCRでTaqが好まれる理由としては、 ・プローブ法では二本鎖特異的5' exo活性が必要だから。 ・キャリーオーバーをウラシルDNAグリコシラーゼで防ぐ系では基質にdUTPを加えるが、TaqはdUTPを基質にしても伸長効率が落ちないから。 なんかがあると思います。 real time PCR用製品ではTaqが使われる明確な理由を知っている人がいたら教えてほしいですね。

(無題) 削除/引用 No.11883-3 - 2023/10/27 (金) 22:47:52 - PCR ありがとうございました。考慮できていなかったので大変助かりました。 SYBR Green Realtime PCR Master Mix のポリメラーゼって Taq としか書いていません。なのでおそらく使えるということだと思うのですが、私と同じような目的のためにあえて普通の Taq が採用されているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11883-2 - 2023/10/27 (金) 20:27:03 - G25 既に考えに入れていると思いますが、PCRに使う酵素に注意。 校正活性(3’ exonuclease活性)がある酵素だとプライマーの3’ ミスマッチを削って、PCRが走ってしまいます。校正活性のないストレートなTaq polが適しています。 3‘末端の1~2 nt のミスマッチでアリルを区別することだって可能ですから。

PCRのプライマー設計 削除/引用 No.11883-1 - 2023/10/27 (金) 19:51:51 - PCR PCR のプライマーを設計する際、約20bp のプライマーにするとして、3'末端の５塩基の配列が相補的でなくなったらフラグメントは増えないと考えても大丈夫でしょうか。スプライスバリアントは増幅したくないので、エクソンをまたぐようなプライマーを設計しようとしています。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---