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(無題) 削除/引用 No.11856-2 - 2023/10/17 (火) 18:26:06 - ossi 抗生剤も使っているということは、レンチにはgRNAと蛍光タンパク質と薬剤耐性遺伝子の3つが一緒にのっているということでしょうか。 蛍光タンパク質や薬剤耐性遺伝子のプロモーターにCMVとかサイレンシングされるものを選んでいるのではないですか? Cas9の発現にも同じプロモーターを使っていたら、同じように2週間で消えているかも。

Cas 削除/引用 No.11856-1 - 2023/10/17 (火) 17:03:37 - APC 3D培養に対して、Cas9スクリーニングを試みているのですが、いくつか課題が見えてしまい、NGSによる解析に進めず、難渋しています。 最初の過程は問題がなく、Cas9 expressing cellsは準備して、これはCas9が発現することの確認は取れています。その細胞に対して、gRNAのレンチを感染させた後に、1週間ほど経つと、蛍光が減弱するのが問題です。 通常は2週間かけて、合計3回セレクションをかけて、スクリーニングを行うので、1週間で減弱してしまうと蛍光での陽性細胞の選別ができないのですが、何か解決策はありますでしょうか。抗生剤のセレクションもかけたのですが、選別が上手くかからない印象です。 1.減弱する理由がよく分からない 2.そもそも、蛍光が減弱すると、Cas9による切断が効いているのか自信が持てないですが、Cas9って、短期間でも劇的な切断効率があるものなのでしょうか。 3.全体的な解決策 このあたりが今の論点でしょうか。他に気になる点があればこれもアドバイスいただけたらと思いますが。

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