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(無題) 削除/引用 No.11855-6 - 2023/10/17 (火) 23:17:56 - toto 2G程読まれてましたか。それはもったなかったですね。control plasmidであれば10分もrunすれば１Ｍbくらい読めるので十分でした。というかrapid sequencingであればやる必要はないですし、ligation seqでもまず要らないと思いますよ。私はやったことないです。 遮光は先月ONT社が急に言い出した話で、どうもこれがcommunityで炎上気味になっていたver10.4.1のトラブル（急速なポアの失活）への対応のようです。これ以降、そういう苦情がめっきり減りました。たぶん、新しいclick chemistryの試薬のせいじゃないかな。light shieldとかよんでるsample chamberの目隠しをONTは出してるようですが、Mk1bだと暗室で手元ランプでrunしたほうがいいのかもしれません。どれくらいまでlight sensitiveなのかの情報が全くないので。washのときも遮光しろといってて、なかなか面倒です。 ナノポアはversion upが頻繁で、こういう重要な情報が突然出てきたりするので、runの前にnanopore communityを覗いておくことをお勧めします。そういえばMk1bはguppyからdoradoがdefaultになったようです。

(無題) 削除/引用 No.11855-5 - 2023/10/17 (火) 22:38:28 - ばいお G25様 ご回答ありがとうございます。 ラン中、activeなポアが減少していくのは確認していました。 unavailableとなったポアが多い場合のトラブルシューティングにwash kitがあったと思ったので、ある程度は戻るものかと思っていたのですが、そうではないのですね。勉強不足でした。 次回からはランを切るタイミングなど気をつけます。

(無題) 削除/引用 No.11855-4 - 2023/10/17 (火) 22:25:02 - ばいお toto様 ご回答ありがとうございます。 Control runは、estimated basesは1.98 Gbとありました。 恥ずかしながら、ランが良いところで勝手に止まるものと勘違いしていたため、長くかけていました。 ナノポア社のサイトから確認できる、control run用のプロトコルを参考にしていたのですが、こちらには遮光についての記載がなく、後に知りました。 なのでランを実施した時は遮光はしておりません。 使用しているのはMk1Bです。遮光も大きく影響するのですね。次回は気をつけます。 バクテリアなら400でもいけるとのこと、情報ありがとうございます。シーケンスしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11855-3 - 2023/10/17 (火) 21:31:49 - G25 シークエンスランをしている間にもどんどん生きたポアは減っていきますよ。ランをしているときにポアの状態もリアルタイムでモニタできるはずだったと思いますけど、生きたポアは経時的にどんどん減っていきます。 フローセルをフルに使い切ったときは生きたポアがゼロ近くになるとき。 MinIONでポアがゼロになるまでランするには2-3日かかったように記憶しますが、Flogleだと一晩のランでほぼゼロになります。 MinIONを使い切るまえにランを止めて、洗って数回使うというのは、ポアを消費しきらないでランを止めて、生きのこったポアがを次回のランで使うということにほかなりません。洗うというのはポアを洗って再生するというのではなく、シークエンスバッファやサンプルを洗い流して生き残ったポアを保護保存するバッファに置換するということだと理解しています。

(無題) 削除/引用 No.11855-2 - 2023/10/17 (火) 17:12:43 - toto Flowcellはちょっとしたことですぐにポア数が減ります。control runは何塩基くらいよまれましたか？それに寄ります。それから、サンプルポートは遮光されてます？Mk1bだとかなり気をつかいますが。ゲノムのサイズに寄りますが、バクテリアなら400でも行けます。

ナノポアシーケンサーMinION フローセルについて 削除/引用 No.11855-1 - 2023/10/17 (火) 15:20:38 - ばいお いつもお世話になっております。 ナノポアシーケンサーMinIONのフローセルについて質問がございます。 ラボで初めてナノポアシーケンサーを購入し、λDNAのコントロールランを実施しました。 使用したフローセルをwash kitを用いてwashし、PCに繋げてフローセルチェックを行ったところ、 コントロールラン前はactive poreが1400程度あったのに、ラン後は400に下がっていました。 使用経験のある方にお聞きしたいのですが、 �@wash すれば何度が使用できるものと認識していたのですが、一度の使用でここまでactive poreの数は下がるものでしょうか。 �Aポアの数が400程度ではゲノムのシーケンスは厳しいでしょうか。 �Bどういった要因で、poreの数は減るのでしょうか。ちなみに、気泡は入っていません。 ラボで初なもので、相談できる者がおりません・・。 ご教示頂ければ幸いです。 よろしくお願い致します。

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