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(無題) 削除/引用 No.11832-13 - 2023/10/07 (土) 20:38:16 - あの 御自身でのある程度の試行錯誤は必要ですし、当方はあいにくと、全く同じ条件での経験はありません。 参考までに、当方ではタンパクを何か、たとえばビオチンとかと分離するためには、次のDNA用のプレパックカラムを愛用しています: 　NAP™-5 Columns この長さのカラムの場合、バッファで洗ってBSAでブロッキングした後に、0.1ml程度のサンプルをロードして、何らかのバッファをロードしながら、目で５滴ずつ数えて、0.5%BSA入りPBS等のタンパク入りバッファ0.5mlを入れた１.5mlマイクロチューブにとっていきます。 昔ラジオアイソトープ標識していたときの経験上、2番目から4か5番目のマイクロチューブが脱塩されたタンパクですので、この範囲を全部回収して利用します。8番目ぐらいから未結合のビオチンで、マイクロチューブで20本ぐらいまでとれば、ベッドボリューム分は採取しきっています。なお精製されたタンパクは濃度が、大雑把には10倍希釈されてしまいます。 何らかのシステムも無くUV検出機も無い状態で、もし自分が試しに実施するとすれば、出来るだけ細長いカラムを用いて、同様に５滴ずつとっていき、ベッド体積分の液をマイクロチューブに取り続けます。あとはアッセイして、どの分画が希望するものか選択します。 より詳細で論理的な考え方は、他の識者の説明を待つとして、、、自分なら上記のようなことで試行錯誤してみます。

(無題) 削除/引用 No.11832-12 - 2023/10/07 (土) 19:30:46 - が 限外ろ過のcut-off値は全くアテにならないと思っていいです。

(無題) 削除/引用 No.11832-11 - 2023/10/07 (土) 19:18:30 - Y あの様 お世話になります。 ゲル濾過、難しそうだなと感じていました。 仮にsephadex G-100で行う場合、50 mM Tris-HCl, pH8で担体をビーカー内で膨潤化、平衡化したのち、それをどれくらいの長さのカラムに充填したらいいでしょうか？ またHPLCがありませんので、マニュアルでフラクションを回収する場合、どれくらいの量を１フラクション内に回収したらよいかアイデアはありますでしょうか？例えば1 mlずつなど。 その後、全フラクションをウエスタンかCBB染色をしてみて、該当するタンパク質がどこに含まれるのか、100 kDaの不要なタンパク質がどこに含まれるかを調べることは可能かと思います。 ご意見いただきまして、ありがとうございます。 また、BSAについてもとても勉強になりました。 実はNi-NTAを用いて細胞培養上清から精製する際はFBS中のBSAがNi-NTAに結合しやすいとかで、タンパク質精製時にはよくないタンパク質であるとの認識でしたので、目から鱗でした。

(無題) 削除/引用 No.11832-10 - 2023/10/07 (土) 19:02:27 - あの 念のため補足ですが、カラム等にタンパクが吸着するロスを想定して、カラムにはあらかじめBSAなどのタンパク溶液を先に流してから、サンプルをロードすることが重要です。

(無題) 削除/引用 No.11832-9 - 2023/10/07 (土) 18:51:16 - あの 精製前も初心者向きで、精製後のダメージも少なさそうという点で、当方ならゲル濾過を使います。 いずれの精製法にせよ、どの分画に欲しいものが入っているかを調べるアッセイ系を、あらかじめ確立しておくことが必須です。たぶんそのウエスタンで良いでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.11832-8 - 2023/10/07 (土) 17:53:32 - Y >> アミコンの50 kDa cut-offの限外濾過 45kDaだから50より小さいので通過するとは限らない。分子の形状などによっては通らない事もある せめて70-80ぐらいのカットオフでぶんりしたいところだけど、アミコンには50の次は100なので、、、 おお様、 ありがとうございます。 アミコンチューブの側面に書かれてあるcutoff値通りに綺麗には分離できないとは思いますが、30と50 kDaのアミコンチューブがあるので、そのどちらかでうまくいけばと期待しています。

(無題) 削除/引用 No.11832-7 - 2023/10/07 (土) 17:51:58 - Y おお様 この度はお世話になります。 > ただ、ゲル濾過はある程度しっかりとしたカラムの長さが分離に必要。イオン交換ならそこまで厳密でなくてもいいし、分離できる可能性はかなりある。 ご意見いただいて、ゲル濾過はタンパク質精製の素人には難しそうな印象をいだきまして、逆にイオン交換はうまくいくかもという期待をいだきました。 このような素人の私相手に経験則に基づくコメントをいただくことができ、トピックを立てて本当に良かったと思っています。ありがとうございます。 QAEを使った陰イオン交換を少しだけ行ったことがありますが、陰イオン交換の担体として、QAEとDEAEがあった場合、何も情報がないタンパク質の時にはまずはQAEだと昔聞いたことがあります。 またQAEにも25と50があります。 質問に質問を重ねて恐縮ですが、以下２点につきコメントをいただけませんでしょうか。 1. 陰イオン交換樹脂として、QAEでまずは行ってみるべきでしょうか？ 2. 25と50の場合、どちらが今回はおすすめでしょうか？ 大変恐縮ですが、ご意見伺えますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11832-6 - 2023/10/07 (土) 17:43:03 - Y 774様 この度はお世話になります。 おそらく分離していると思っています。 といいますのも、C末を認識する抗体でIPしますと、100 kDaのものは落ちてこなかったため、nativeな状態では両者は切り離されていると考えています。

(無題) 削除/引用 No.11832-5 - 2023/10/07 (土) 15:59:17 - おお >[Re:3] 774Rさんは書きました : > 100kDaと45KDaのタンパク質は溶液中で分離してるかどうかについては分かりますか？ > ニックが入っただけで立体構造が壊れていない場合、電気泳動では分離して見えますが、溶液中で分離するためには変性させるような処理が必要になります。 変性までいかなくても、500mMぐらいの塩濃度(NaCl)とか変性能力に乏しいカオトロピックな試薬(LiCl)、場合によってはpHなどで離れると思う。おそらく変性させるようなと書いているので、そう言う含みを持たせて書いていると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.11832-4 - 2023/10/07 (土) 15:52:24 - おお >[Re:2] Yさんは書きました : > 続けて失礼します。 > > もしゲル濾過、陰イオン交換を行うならば、45 kDaの100 kDaからの分離を考えると、sephadexの排除限界は小さい方がいいでしょうか？ https://www.researchgate.net/figure/Exclusion-limits-of-sephadex_tbl1_237021946 https://www.researchgate.net/post/Can-anybody-help-me-in-the-selection-of-sec-gel-type Sephadex Gシリーズなら100kDaあたりが排除限界のG -100辺りがいいのでは？100kDaが先ず素通りのフラクションに出てきて、それ以下が遅れて出てくるので最大限に分子量の分離能をいかせる。 ただ、ゲル濾過はある程度しっかりとしたカラムの長さが分離に必要。イオン交換ならそこまで厳密でなくてもいいし、分離できる可能性はかなりある。 もし、切断はされていても構造が保たれているみたいなら、高塩濃度に晒すなどした方が良さそうだからそうするとイオン交換に直接つけれない。ゲル濾過の方がカラムにすぐ乗せれる。 > アミコンの50 kDa cut-offの限外濾過 45kDaだから50より小さいので通過するとは限らない。分子の形状などによっては通らない事もある せめて70-80ぐらいのカットオフでぶんりしたいところだけど、アミコンには50の次は100なので、、、

(無題) 削除/引用 No.11832-3 - 2023/10/07 (土) 14:19:45 - 774R 100kDaと45KDaのタンパク質は溶液中で分離してるかどうかについては分かりますか？ ニックが入っただけで立体構造が壊れていない場合、電気泳動では分離して見えますが、溶液中で分離するためには変性させるような処理が必要になります。

(無題) 削除/引用 No.11832-2 - 2023/10/07 (土) 14:08:06 - Y 続けて失礼します。 もしゲル濾過、陰イオン交換を行うならば、45 kDaの100 kDaからの分離を考えると、sephadexの排除限界は小さい方がいいでしょうか？

タンパク質精製（ゲル濾過、陰イオン交換） 削除/引用 No.11832-1 - 2023/10/07 (土) 14:01:48 - Y いつも勉強させてもらっています。 今、組換えタンパク質の先生を行っています。 培養細胞に分泌させた、N末にGSTが付加された目的タンパク質Aを精製しようとしています。 グルタチオンビーズを用いて、綺麗にシングルバンドが得られたことを確認し、その後、GST付きPresission proteaseで切断し、再度グルタチオンビーズで精製したところ、目的タンパク質Aが二つに分断されていることがわかりました。 具体的には100 kDaと45 kDaです。 この二つを分離できないかと考えています。ちなみに、C末にはわけあってタグは付加できていませんが、C末を認識する抗体を使ったウエスタンによると、45 kDaの方にC末が含まれることがわかっています。 ゲル濾過や陰イオン交換は経験ありませんが、もし分離可能性があるのであれば、勉強してトライしてみたいです。 そこで質問は、100 kDaと45 kDaの分離をすることになった場合、その選択肢として、ゲル濾過や陰イオン交換は第一選択になりますでしょうか？ あるいは、アミコンの50 kDa cut-offの限外濾過の方が第一選択になりますでしょうか？ できれば、45 kDaのみを精製できたら嬉しいです。 タンパク質精製は素人で、HisタグやGSTタグでの精製しか経験はありません。 ご教示いただけましたら幸いです。

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