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(無題) 削除/引用 No.11825-13 - 2023/10/05 (木) 10:45:15 - おお Good luck!

(無題) 削除/引用 No.11825-12 - 2023/10/05 (木) 10:13:19 - BAX 蛍光とともに、抗生剤耐性はあるはずなのですが、浮遊性細胞なのでプロモーターが十分機能していないのか分かりませんが、至適濃度で選別すると両方とも生き残ってしまいます。 とりあえず、今日は、ROCK inhibitorと100のno GFP cellの組み合わせをいくつか作って、試してみました。 conditioned mediumの定義が曖昧なのですが、調べてみると、普通の培養細胞の上清もある種のconditioned mediumらしいので、使用中のmediumをろ過して使ってみました。今日のところは。

(無題) 削除/引用 No.11825-11 - 2023/10/05 (木) 08:56:17 - LPS 放射線処理したMEFはクリーンな感じでいいですが、照射の条件にもよるでしょうが、全く増殖が止まるわけではなかったように覚えていますが。ES細胞は圧倒的な速さで増えるので全く問題にはなりませんが。 浮遊系と言えば、ハイブリドーマの限界希釈のフィーダー細胞は、脾細胞を使っていましたね。

(無題) 削除/引用 No.11825-10 - 2023/10/05 (木) 07:50:31 - おお >[Re:9] おおさんは書きました : > >[Re:8] おおさんは書きました : > > > それならその親株（薬剤耐性を持たないもの）と混ぜて培養して、ある程度増えたら薬剤で親株を除いてしまうっていうのもあり得る手段かもしれません。 > > ん、薬剤でなくてもフローサイトメトリーでＧＦＰポジ集めてもいいかも。このときはＧＦＰポジ全部集めて１つのＷｅｌｌで培養すればいいし。 96ウェルでやっているなら３８４にしてみるのも手かと。細胞が分泌するものがあまり希釈されないようになるので。親株を入れないにしても。 ３８４なら上で書いた方法のときも親株の数も少なくて済むので増えてきた時のＧＦＰポジのポピュレーションも多くなると思うので、どこ行ったか分からないまま進めて結局ＧＦＰポジがなかったとかいうのも避けれそうです。

(無題) 削除/引用 No.11825-9 - 2023/10/05 (木) 02:50:48 - おお >[Re:8] おおさんは書きました : > それならその親株（薬剤耐性を持たないもの）と混ぜて培養して、ある程度増えたら薬剤で親株を除いてしまうっていうのもあり得る手段かもしれません。 ん、薬剤でなくてもフローサイトメトリーでＧＦＰポジ集めてもいいかも。このときはＧＦＰポジ全部集めて１つのＷｅｌｌで培養すればいいし。

(無題) 削除/引用 No.11825-8 - 2023/10/05 (木) 01:47:30 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5522833/ NK cellsの培養にperipheral blood mononuclear cells を混ぜてますね。 そのGFP融合タンパク質を発現している浮遊性細胞は薬剤耐性を獲得しているのでしょうか（その方法もちょっと気になりますが、それはわき道にそれてしまうので置いときますが）？ それならその親株（薬剤耐性を持たないもの）と混ぜて培養して、ある程度増えたら薬剤で親株を除いてしまうっていうのもあり得る手段かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11825-7 - 2023/10/05 (木) 01:32:20 - おお >[Re:6] G25さんは書きました : > >4.フィーダー細胞持っていないのですが、なんでもいいわけではないですよね。。。 > > irradiated feeder cellsは自前で作るもんです。 > X線照射装置もっている近所の研究室に頼んで使わせてもらえないか？ Mitomycinで処理して増殖しないようにする方法もありますＥＳのフィーダーとしてＭＥＦをMitomycinで処理して使うのはよく見かけました。今はどうしているかわかりませんが。 https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/CBA-310-mef-feeder-cells.pdf ただ浮遊細胞で血球系ですかね。。。フィーダーを使うってあまり聞かないけど、フィーダーに何を使えばいいか調べないと見当つかないですね。。。血管内皮細胞とかですかね、、、 > > conditioned mediumにしてもirradiated feeder cellsにしても、 > メジャな手法なので、詳細については実験書や文献をあたってみてください。 conditioned mediumは真っ先に思いつく方法です。

(無題) 削除/引用 No.11825-6 - 2023/10/04 (水) 17:56:07 - G25 >4.フィーダー細胞持っていないのですが、なんでもいいわけではないですよね。。。 irradiated feeder cellsは自前で作るもんです。 X線照射装置もっている近所の研究室に頼んで使わせてもらえないか？ conditioned mediumにしてもirradiated feeder cellsにしても、 メジャな手法なので、詳細については実験書や文献をあたってみてください。

(無題) 削除/引用 No.11825-5 - 2023/10/04 (水) 17:37:58 - BAX 1.Y27632を添加するというのは知りませんでした。 2.新しいmediumよりも、細胞を培養していたmediumをfilteringした上で使うのがいいのでしょうか。 3.陰性細胞を100細胞入れておいて、そこにGFP陽性細胞を1個入れて、再度ソーティングするとかもアイデアでしょうか。 4.フィーダー細胞持っていないのですが、なんでもいいわけではないですよね。。。 一番、試しやすいのは、1ですね。

(無題) 削除/引用 No.11825-4 - 2023/10/04 (水) 17:29:58 - qq 親株を限界希釈でクローニングしておいて、そこに遺伝子導入・クローン化するといいんじゃない？ まあ、そもそもクローニングできないのかもしれませんから、無意味かなぁ。

(無題) 削除/引用 No.11825-3 - 2023/10/04 (水) 16:14:45 - G25 ・conditioned mediumを使用する。 ・irradiated feeder cells（使用する細胞と同株の細胞を殖やしてX線/γ線照射し、増殖能を失いやがて死にゆくだけにしたもの）と共培養する。 培養細胞自身が培地中に分泌する成長因子や細胞外マトリックスなどを補い、細胞密度が低いがために起こる増殖力の衰えを緩和する。

(無題) 削除/引用 No.11825-2 - 2023/10/04 (水) 16:11:41 - おお この手の質問は良くあるので過去ログを見てほしいのだが、あえて一つ書くと https://www.tocris.com/products/y-27632-dihydrochloride_1254?gclid=Cj0KCQjwmvSoBhDOARIsAK6aV7hhFICut-FV5dYIL-HZBIz5SYRtZMWkaJEWsAnQy_dhWHwwuw9j0zgaAh6nEALw_wcB&gclsrc=aw.ds こう言うのを使うてはあると思う。 浮遊細胞ってマトリジェルとか有効なんでしょうか？分泌したものがトラップされたり拡散が抑制されたりするので、オートクラインの効果が底上げ出来るかもしれない。

限界希釈した細胞を生き残らせる方法 削除/引用 No.11825-1 - 2023/10/04 (水) 15:22:19 - BAX GFP融合タンパク質を発現している浮遊性細胞をフローサイトメトリーで1細胞に分画していますが。培養すると細胞が死んでしまい増殖しません。 元のmediumはRPMIですのでそのまま使っていますが、どうやったら、生き残らせられるのでしょうか。

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