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(無題) 削除/引用 No.11824-11 - 2023/10/06 (金) 23:43:55 - Beads ビーズをどれくらい洗っていいのかいつも迷うのですが、みなさんピペッティングはどれくらい強く行っていますか。

(無題) 削除/引用 No.11824-10 - 2023/10/06 (金) 18:17:26 - 喫茶 銀染で差が見えないくらいでもMSでは検出できたりするくらいMSの感度は高い。 ビーズは、ちゃんと免沈で実績あるメーカーのを使わないとダメ。タンパクの低非特異吸着をメーカーが謳っているビーズって選択肢が少ない。 ビーズへの吸着がこの論文くらい少なくないときびしい。 ttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21047794/

(無題) 削除/引用 No.11824-9 - 2023/10/06 (金) 11:11:12 - asan 1. WT vs Mut などの同じような分子の中の一部の結合が変化する、ことを想定してるなら比較定量するだけですが、beads単体でもたくさん銀染色レベルで検出できる溶出があるならバックグラウンドが高すぎると言わざるを得ません。 2. バックグラウンドを減らすためのwash条件を見直す必要があります。beadsを吸わないように注意しすぎて、cell lysatesそのものを大量に持ち込んでたりしませんかね？ 3. 結合そのものが少ない場合は、1そもそもそのタンパク質に結合するものが少ない、2.過剰させすぎていてほとんどが細胞内で無意味な発現になってる、3. IPに用いるlysatesそのものの量が少なすぎる、4 IPやlysis条件が悪い。 などが考えられます。たとえば、転写因子なら核抽出して行いますが、十分なコンプレックスを取る場合はかなりの大量培養が必要です。 逆に、293などにただ発現させて回収するだけなら10cm dish1xもあれば十分でしょう。 銀染色で全く見えないぐらいまでバックグラウンドを抑えるのが普通とは言いませんが、IPしたものでも全体ではっきりとしたバンドが見られ、IPとほとんど変わらないとすると流石にバックが多すぎます。 目的がただの結合タンパク質をとるだけならSILACにする必要もないとおもいますので複数回行って再現性のある結合タンパク質を取るためにも、IP条件はある程度最適化したほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.11824-8 - 2023/10/05 (木) 22:10:31 - dfvty IPのバックグラウンドを減らす方法 １　　アガロースヤセファロースビーズではなく磁性ビーズを使う。（ビーズ内部への非特異的な吸着がないのと遠心しないので微細な不溶物の混入を回避できる点） ２。　0.5M程度のNaCl を含むbufferによる洗浄を１回入れる。相互作用が減弱してしまうならしない方がいいが、経験ではこの程の濃度ならば大抵は維持できることが多い。 ３。　プレクリーニングはいろいろな本で推奨されてるので、やつてみる価値はあると思いますが、私は実際に何度かやってみてましたが、それほどありがたいと感じたことはこれまでないです。なので最近はしてません。 4. タンパク質A,Bが,今使ってるlysis bufferで十分可溶化できてるかどうかはwestern blotting等で確認してください。何度かやってもうまくいかないという人の中に、もともとそこに無いものを追いかけてる人結構いるので。 内在性のものをIPで捕まえてくるのが正攻法だけど、やむをえず強制発現させてIPする場合は、Hsp70とか９０とかHSC70とかの分子シャペロンがそれの相互作用する仲間のタンパク質とかプロテアソームかんけいの分解系のタンパク質とかも一緒にくっついてくることあるので気をつけたほうがいいです。もちろん、対象のタンパク質が生理的条件でそれらと相互作用してるかもしれないのでただしい結果かもしれないけど、アーティファクトかもしれないので、結局そのタンパク質の抗体買って内在性タンパク質でIPして調べる必要が出てくるのです。

(無題) 削除/引用 No.11824-7 - 2023/10/05 (木) 21:10:30 - あああ 私もSILACでやってできました。 バックグラウンドが高いままやり、それでもできないことはないですが検出されるタンパクが沢山増えて、一つづずつ丁寧に比較しないといけなくなって本当に大変でした。それでも良いならバックが高いままやれば良いですが、バックを減らす努力を先にするか、バックが高いままMSデータを丁寧に解析するか、労力をどっちに割くかです。バックが高いと挫けそうにはなりますが、洗いを強くすると結合たんぱくまで無くなってしまうかもしれません。。。

(無題) 削除/引用 No.11824-6 - 2023/10/05 (木) 18:32:12 - Beads 最近のmassは高感度なので、SILACではなくてもセミ定量的に比較できると聞いています。 文献を見てみると、意外と共免疫沈降の銀染では、強発現させたタンパク質は見えるか見えないかくらいの時もかなりあるようですね。 となるとこれで、突き進んでも問題ないんですかね。。。

(無題) 削除/引用 No.11824-5 - 2023/10/05 (木) 17:59:47 - dfvty 書かれた内容からは、目的を達成するのは困難と思います。 培養細胞系であればProteomicsではかなり標準的な手法としてSILAC（安定同位体標識した必須アミノ酸アミノ酸を利用する方法）という方法があります。この方法ならば、多量に含まれるバックグラウンドのコンタミのタンパク質のがあるなかでも２群なり３群の間で量的に差異（たとえばnormal IgG Negative cont ビーズよりも抗体ビーズのほうにおおいものなど）のあるタンパク質をマスのデータから見つけることができます（つまりこの方法では精製度はあまり重要ではありません）。専用の培地キットが売ってると思うので調べてみてください。質量分析は外部委託になります。実験のデザインをする上でできれば、あるていど生化学のバックグラウンドとキャリアある方、および委託先めーかーの専門家によく相談することを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.11824-4 - 2023/10/04 (水) 03:57:25 - おお V5タグをつけたタンパク質AとBも見れないのですね。そうなるとちょっと心配ですね。ＷＢでは検出されますか？Ｌｙｓａｔｅからの回収率も気になるところです。 回収率の問題ならＩＰなどの条件を改善も考えてみる必要があるかもしれません。 Ｖ５タグでもしかしてＶ５−Ｈｉｓになってませんか？ Ｎｉビーズで回収して、再度Ｖ５でＩＰというスキームも取れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11824-3 - 2023/10/04 (水) 01:21:05 - Beads 前回はもう少し小さい25kDくらいの分子を扱っていました。この際は、がっつりと銀染だけでも、baitのバンドが見えたのですが、今回はのバンドも見えません。こんなものでしょうか。。。あり得ますか？ 何か実験系に問題がありますかね。。。

(無題) 削除/引用 No.11824-2 - 2023/10/03 (火) 23:44:07 - おお 実際うちのラボはそれでやってました。やっている人にそんなんでできるんかと攻め寄ってたんですが、いっぱいあるコントロールのたんぱくを差し引いてなんとか結合しそうなものを抽出していました。 まぁ保証はできないんで、もう少しなんとかならんかとは思います。

免疫沈降後の質量分析 削除/引用 No.11824-1 - 2023/10/03 (火) 21:55:37 - Beads V5タグをつけたタンパク質AとBとタグだけのコントロールの3種類のプラスミドを用意して、AとBの新規結合蛋白質を同定したいと考えています。 それぞれに関して、強制発現させて、共免疫沈降をして、銀染色でバンドパターンを比較したのですが、ほぼバンドパターンが同じです。おそらくビーズに非特異的にある程度くっついてしまうのだと考えています。 目的のタンパク質が発現していることはWBで確認しているのですが、そのままゲル全体を感度のいい質量分析にかけたら、3つを比較できるので、結合蛋白質を同定できるのではと考えているのですが、甘いでしょうか。

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