全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11820-10 - 2023/10/04 (水) 12:00:37 - もやもや 皆様 色々とお示しいただきありがとうございました。 自分なりに試して見たいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11820-9 - 2023/10/04 (水) 11:16:43 - G25 >・十分量の溶媒を加える。10 mM TrisかTEを使用する（TEを使うことでダウンストリームの実験がだめになることはまずない）。 DNAはリン酸基が電離することで極性を帯びて水に溶けるけど、弱酸なのでpHを高めに保たないと電離度が下がり溶けにくい。特に大量のDNAを純水に溶かすのは困難。10 mM, pH 8程度のTrisバッファーが良い。 二価の金属イオンとDNAは難溶性の塩になるので、EDTAがあったほうが溶けやすい。

(無題) 削除/引用 No.11820-8 - 2023/10/03 (火) 18:37:27 - Skeptics 理解しました。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.11820-7 - 2023/10/03 (火) 17:42:50 - G25 TES (0.1 M Tris-HCl (pH 9)/ 0.1 M EDTA/ 1% SDS) (オプションでproK添加）に懸濁して70℃ 20-30 min 。 1/2 vol 7.5 M NH4OAcを加え氷冷 20-30 min。 タンパク質SDS複合体が塩析するので、遠心して上清を回収。 アルコール沈殿でDNAを回収。 これだけでも、ほとんどの目的に十分使えるが、 オプションでアルコール沈殿前か後に（後だとsmall volumeでできるメリットあり）PCI抽出。 動物組織、細胞、細菌、昆虫などに応用可（もちろん材料によってはホモジナイズが必要）。 高分子量のgDNAのpptが溶けにくいのは当然で ・EtOHリンスの後、乾かしすぎない、あるいはアルコールをできるだけ除去するだけで乾かさない。アルコール添加で析出したgDNAを熱して曲げたガラスキャピラリーで釣り上げ、きれいなろ紙でアルコールを吸い取っただけで、溶媒に突っ込むなんてこともやった。 ・十分量の溶媒を加える。10 mM TrisかTEを使用する（TEを使うことでダウンストリームの実験がだめになることはまずない）。 ・O/Nあるいはそれ以上の時間をかけ気長に溶かす。

(無題) 削除/引用 No.11820-6 - 2023/10/03 (火) 17:13:28 - Skeptics PCRの鋳型に使うのならわざわざ大量の細胞からではなく、その一部だけを使ってゲノムDNAを調製すればよいように思うのですが、それではいけない特別な理由があるのですか？

(無題) 削除/引用 No.11820-5 - 2023/10/03 (火) 15:37:37 - 小学生 小学校の授業で肉や野菜からDNAを取り出す実験やったよ。 自由研究用の道具も売ってるよ。

(無題) 削除/引用 No.11820-4 - 2023/10/03 (火) 15:07:36 - 774R シリンジと注射針を使って数回ストロークさせるとサラサラになります。 恐らく、この方法なら200bpのアンプリコンの増幅に影響ない程度の断片化しかしてないと思われます。

(無題) 削除/引用 No.11820-3 - 2023/10/03 (火) 11:28:44 - おお proKからPCI等のあとに６Ｍぐらいになるように尿素を加えてからエタチンするとかなりきれいになるので溶けやすくなります。

(無題) 削除/引用 No.11820-2 - 2023/10/03 (火) 11:27:01 - 古い記憶 古典的なProKを使った方法で肝臓からゲノムDNAを抽出するときは15mLチューブで操作してました。遠心もゆっくりで、フェノクロ後のエタチンのために100%エタノールを加えると、遠心無しでピペットマンのチップに絡みつくぐらいのゲノムは取れます。それをチップでつまんで別のチューブに移してTEに入れて冷蔵庫で2日ぐらいかけて溶解させた思い出。

ゲノムDNAの抽出 削除/引用 No.11820-1 - 2023/10/03 (火) 10:18:37 - もやもや 大量の細胞（10^8オーダー）からゲノムDNAを効率的にとるおすすめの方法はありますでしょうか？ ゲノム抽出後はある領域を対象にPCR(200bp程度）をかけてアンプコンシークエンスをする予定です。 シリカカラムのキットでとるのがきれいですし、PCRのかかり方も良いように思いますが、細胞数が多いとどうしても粘稠性が高くなり、カラムに詰まったりするので大量のカラムを使用しなければいけなくなり、費用的にもなかなか大変です。 また古典的なproKからPCI等で試したのですが、細胞数が多いとやはりDNAが不溶化してしまい難しいところがあります。 超音波処理で短くする方法もあるかと思いますが、PCRのかかり方などに影響がどれぐらいあるのか心配です。 何かいい方法がありましたら、ご教授いただけますと幸いです。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---