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(無題) 削除/引用 No.1182-6 - 2012/11/26 (月) 17:40:33 - kamikaze みなさんご回答ありがとうございます。 もう一度条件を変えず同じ実験をしてみたところカラム精製後のサンプルでも正しい位置にバンドが出るようになりました。 カラムはシリカマトリクスタイプのカラムです。 今回このような現象が起こった原因は不明のままではありますが、取り合えず今回のサンプルを使って実験を進めていきたいと思います。 意見をくださった皆様には心より感謝申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1182-5 - 2012/11/26 (月) 10:37:49 - ~ >今回精製後の 今回の結果というのは、どの範囲において再現性があるのでしょうか？ ・カラムのロット ・バッファーのロット ・プラスミドのロット 再現性が得られないのであれば、原因追及は困難でしょうから、 新しく調製しなおしたDNA断片を使ってその後の作業を続けるのがいいと思いますが。 原因の候補が欲しいのであれば、制限酵素のコンタミや、プラスミドのコンタミ等でも同じ結果は得られうるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1182-4 - 2012/11/26 (月) 10:17:14 - 中年 目的の大きさでないバンドというのは、カラムに掛ける前には存在していないことは確かですか？過剰なアルカリ処理で生じるssDNAということはないでしょうか。 また、pUC19に2.6kbのインサートを入れたものをシングルカットということは、5kb以上のDNA断片ということですよね。シリカマトリクスタイプのカラムだと、ここまで長いと収率が落ちるのは仕方がないように思います。

(無題) 削除/引用 No.1182-3 - 2012/11/24 (土) 18:14:07 - AP 二、三、不明の点がありますので確認です。 そのスピンカラムというのはどういうタイプですか。ゲルろ過？　シリカマトリックス？ シリカ方式であるキアゲンでは、「短い」二重鎖DNAが変性することがあるということがマニュアルに載っていますが。 それと、目的の大きさでないというバンドは、制限酵素消化後のゲル電気泳動では見えていないバンドということでしょうか。精製というのは、ゲルからの切り出しですか、それとも消化物から直接の精製ですか？

(無題) 削除/引用 No.1182-2 - 2012/11/24 (土) 18:10:52 - おお 変性といってもどんな変性をお考えなのか、、、 2本鎖が開くようなものなら、まずないでしょう。そのほか、ケミカルに反応性があるとも思えませんし。 もしかしたら、HindIII酵素処理が何らかの理由で不完全なのでは?のそカラムで精製したもののいちぶをもう一度HindIII処理してえいどうして(カラムを通す必要ないですから)確認してみてはどうでしょうか?

DNAスピンカラム精製後のDNA変性 削除/引用 No.1182-1 - 2012/11/24 (土) 17:02:45 - kamikaze いつもお世話になっています。 このたびいつものように今までに何度もこなしてきたDNAスピンカラム精製をしたのですが、いつもと違う状況に出くわしてしまい困っています。 DNAはプラスミドで、pUC19に2600bpほどのインサートを入れたものです。 このDNAを制限酵素(HindIII)でシングルカットして、線状化されたDNAを精製するという実験です。 これまでは同じDNAで同じ実験をして目的の大きさのDNAを得れていたのですが、今回精製後の電気泳動の結果バンドが目的の大きさと目的の大きさでないところにもバンドが出てしまいました。 その上目的の大きさのDNA量は以前に比べ感覚的にですが少なく感じ、DNAがカラム精製中に変性でもしたのかとおもっています。 そこで質問なのですが、 カラム精製中にDNAが変性するということはありえるのでしょうか？ だとしたらどうして以前はうまく精製できたのに今回だけこのような状況になったのでしょうか？ また別の原因が考えられるとしたら何が原因なのでしょうか？ ほしいサンプルはシングルバンドのきれいな線状化されたDNAで、今のサンプルをそのまま使うわけにはいきません。 質問に答えていただけたら幸いです。よろしくお願いいたします。

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