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(無題) 削除/引用 No.11811-20 - 2023/10/03 (火) 10:23:35 - 駆け出し研究者 ぽー様 ご連絡ありがとうございます。 ＞HEK293とHEK293Tの違いは影響していないでしょうか？ 近い細胞ですが、同じ細胞ではないので。 私が説明できておらず申し訳ありません。 ２９３、２９３Tの両細胞で同様の実験を行なっており、同様の結果を得ております。

(無題) 削除/引用 No.11811-19 - 2023/10/03 (火) 10:21:39 - 駆け出し研究者 おお様 ご連絡ありがとうございます。 色々と説明できておらず申し訳ございません。 ＞細胞ないで、そのタンパクの発現を抑制しても気質が分解される状況でどのようにそのタンパクの活性を発現した細胞で測定するのか。相加的に増えるのが見えるぐらいの量の発現が確認されているのか？もしそうでないならなぜ活性がないといえるのか。 我々の主張は下記です。 ・タンパクAを発現している細胞で、タンパクAをノックダウンしても基質は分解される。逆にタンパクAをアップレギュレートする因子が３種ほど知られており、実際に我々の使用している細胞でもタンパクAのタンパク質量は増加する。しかし、そのどれを添加しても基質の分解はなぜか抑制される。 ・HEK293、293T細胞にタンパクAを過剰発現させても基質の分解は見られない。 上記より、タンパクAは基質の分解に関与していないと主張しています。基質の分解と相関する発現変化をしているタンパクBも発見しておりまして、そちらがメインで働いているのではと考えています（HEK293細胞にタンパクBを過剰発現させたところ、基質の分解がみられました）。 私としてはかなりデータを集めたつもりではいるのですが、解明にはまだまだ時間が必要そうです… だからこそ楽しんですけどね（笑） 培地や血清の成分からインヒビターを見つけるのはかなり困難ですが、本当に培地のせいなのかは確認したいと思っています。 スピンカラムで濃縮後に培地で希釈して活性見れば一発かなと…。 さまざま意見頂きありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11811-18 - 2023/10/03 (火) 08:44:29 - ぽー HEK293とHEK293Tの違いは影響していないでしょうか？ 近い細胞ですが、同じ細胞ではないので。

(無題) 削除/引用 No.11811-17 - 2023/10/03 (火) 06:32:36 - おお 細胞ないで、そのタンパクの発現を抑制しても気質が分解される状況でどのようにそのタンパクの活性を発現した細胞で測定するのか。相加的に増えるのが見えるぐらいの量の発現が確認されているのか？もしそうでないならなぜ活性がないといえるのか。 ＞我々としては、仮にタンパクに活性があったとしても、生体内で機能していないのであればあまり意味はないと考えております。 ただが一つ二つの細胞の実験で意味がある、ないと判断していいのかとおもうのだけど。まあ意味を見いだせないという当事者の考えまで否定しませんけど。 その対抗論文の実験だと確かに培地にインヒビターが存在しそうです。培地にある成分のたいていは細胞内にあるようなもんですから、細胞内でもそのインヒビターは作用しているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11811-16 - 2023/10/02 (月) 13:26:35 - 駆け出し研究者 ＞７７４様 ご連絡ありがとうございます。 その論文ではどのように「培地中にインヒビターが存在する」と示しているんです? HEPESや生食に当該タンパク質を放り込んで活性測定したら活性があると? 生理条件とかけ離れた条件で活性があってもあまり意味ないと思うけど。 (生体内局所的に特異な条件ということはありますが) ⇨おっしゃる通りでございます。 HEPESに当該タンパクを放り込んだら活性が見れるとの主張です。 ただ、培養細胞に基質を放り込むと分解されますが、当該タンパクをsiでノックダウンしても変わらず基質は分解されますので、仮に活性を持っていたとしても細胞内で機能はしていないのではと考えております。 もしインヒビターが見つければ面白いと思いますが、なかなか難しいかもしれません。 アドバイスいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11811-15 - 2023/10/02 (月) 13:22:45 - 駆け出し研究者 ＞おおさま ご連絡ありがとうございます。 HBSのFBS入りで剥がれずに耐えてくれた（1day後には剥がれていましたが…）ので、 ギリギリ活性チェックまでいけました。 FBS抜きはすでに検討しており活性が見られないのは確認済みなのですが、DMEMなしでもやはり活性は確認できませんでした。 対抗論文のスピンカラムの謎が深まるばかりです。 我々としては、仮にタンパクに活性があったとしても、生体内で機能していないのであればあまり意味はないと考えております。 生体内においてメインで機能しているタンパクの解明、を常に意識して今後も研究に励みます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11811-14 - 2023/10/02 (月) 13:15:51 - 駆け出し研究者 みなさま、回答いただきありがとうございます。 ご連絡が遅くなり、申し訳ございません。 774R様のおっしゃる通り、我々は生きた細胞での活性を確認しております。 対抗論文の主張は下記です。 ・タンパクAをHEPES Buffer中で基質と混ぜておいたら基質を分解した（酵素活性を示した）。 ・HEK293T細胞にタンパクAを過剰発現させても酵素活性は確認されなかった。⇦私の論文の再現性は相手側も取れている。 ・タンパクAを過剰発現させたHEK293T細胞の培養上清に酵素活性は見られなかったが、スピンカラムで濃縮すると、上清に酵素活性が確認された。 ・さらにその濃縮液をHEPES bufferで元の濃度に希釈しても酵素活性が維持されていた。 上記より、培地中の成分（DMEM、FBS等）がインヒビターとして昨日しているのではとのことでした。 そこで、HEPES Buffer Saline等で培養したら活性が見られるのかトライしておりました。 仮に何かインヒビターがあった場合はそれも一つの大きな発見になりますので、探りたいと思っております。 みなさまのアドバイスを参考に、もう少し別のアプローチができないかも検討いたします。 たくさんのご連絡ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11811-13 - 2023/09/29 (金) 08:47:04 - おお >[Re:6] 774Rさんは書きました : > いや。血清由来なら質問者も血清フリーのDMEMにするはずだけどPBSとか言ってるので、血清由来ではなくDMEMに入ってる成分を問題視してると思われる。 それならＨＢＳＳに血清入れてというのも、、、でも濃度こそ違えど培地成分に含まれているものは、血清にありそうな気もする。。。

(無題) 削除/引用 No.11811-12 - 2023/09/29 (金) 07:52:06 - 774R 失礼しました。再度ページにアクセスしたら連投されてしまいました。

(無題) 削除/引用 No.11811-11 - 2023/09/29 (金) 07:49:02 - 774R 私の見立てでは、in vitroでタンパク質を使ったアッセイではなく、生きた細胞内で酵素活性を見る実験と予想。 前者なら精製したり透析したりで培地成分は除けるので。

(無題) 削除/引用 No.11811-10 - 2023/09/29 (金) 05:28:00 - おお >[Re:9] 774Rさんは書きました : > 私の見立てでは、in vitroでタンパク質を使ったアッセイではなく、生きた細胞内で酵素活性を見る実験と予想。 なるほど。しかしそれなら培養条件が変わると細胞内の状態も（見方によってはドラスティックに）変わるだろうし、培地成分がインヒビターになっていることを否定できるのかという疑問がわきますが、、、うまく何かコントロールを置けるとできるかもしれませんが。まあ、一つのサポートするデーターということにはならなくはないでしょうけど。 あと細胞内にあるその培地成分の抑制効果があるとされるものがあったとしたらクレアランスの問題にも突っ込まないと。

(無題) 削除/引用 No.11811-9 - 2023/09/29 (金) 05:00:51 - 774R 私の見立てでは、in vitroでタンパク質を使ったアッセイではなく、生きた細胞内で酵素活性を見る実験と予想。 前者なら精製したり透析したりで培地成分は除けるので。

(無題) 削除/引用 No.11811-8 - 2023/09/29 (金) 02:02:36 - おお ＞HEPES Buffer SalineやPBS これらのバッファーはＣＯ２のバッファー効果を利用していないのでＣＯ２インキュベーターに入れるとｐＨがどんどん酸性に傾いていきます。ＨＢＳＳは炭酸バッファーが入っていたと思います。 また、指摘があるように血清抜きのＤＭＥＭで培養して分泌タンパクを回収するという手法は取られることがあるようです。 しかしこれらの状況では細胞は増えなくなるし、生理的状況も悪くなり、死んでいく細胞が多かれするなかれ（どれくらいの時間化によるけど）出てくると思われます。 また２９３Ｔなどでよくやるのは２％血清で浮遊してそれでもなおかつある程度の生理状態を維持しているので大量生産で使われたりします。要するに血清を抜くとはがれやすくなってもおかしくないかなとも思います。 で質問を読み返して思うのですが、そういう実験よりも活性あるタンパクをもつフラクションや精製したものに、培地を加えて抑制効果があるかどうかを見るほうが早くないですか？ 活性がなかったという論文を出したということは、活性のあるものをポジコンでおいているのではとちょっと思ったので（明らかに安定した、アッセイならそうでもないかもしれないですけど）、材料はそろっているかそろえれると思ったので。

(無題) 削除/引用 No.11811-7 - 2023/09/29 (金) 00:35:57 - おお だいたいの思ったこと(つっこみ)はすでに指摘がありますが、、、 HBSSのマグネシウム、カルシウム含有とかどうかな。さらにそれに アミノ酸加えるとか。 それより、そのアクセプトされた論文の方法でタンパクを発現させて透析するとか精製するとかするのが早くね？

(無題) 削除/引用 No.11811-6 - 2023/09/28 (木) 22:35:04 - 774R いや。血清由来なら質問者も血清フリーのDMEMにするはずだけどPBSとか言ってるので、血清由来ではなくDMEMに入ってる成分を問題視してると思われる。

(無題) 削除/引用 No.11811-5 - 2023/09/28 (木) 21:51:57 - 独り言 PBSは培養するためのものじゃないですからね。 普通に考えたら、阻害因子とはFBSにたんまりはいっているので、FBSのことを指しているのでしょうか。 そうであれば、293を培養できるSerum free培地を購入して培養すれば、数日は余裕で培養できるので実験できるでしょう。 1日の培養でもいいのであれば、単純にＦＢＳなしのＤＭＥＭでもなんとかなるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11811-4 - 2023/09/28 (木) 19:03:22 - 774R 阻害物質の阻害様式は可逆的ですか？不可逆的（共有結合等）ですか？ 前者であれば十分に薄めることで無視できるので、測定時だけ培地を交換すれば良いのでは。HBSS等でも数時間は細胞を生かしておけます。 それとも一晩とか数日を要するアッセイですか？ HEKは確かにはがれやすいですが、コーティングをしっかりやれば結構平気です。 いまのところ、PEIコート＋コラーゲンコートが良かったです。

(無題) 削除/引用 No.11811-3 - 2023/09/28 (木) 18:11:55 - み 培地中の何の成分が阻害効果をもたらしているのか不明なんですよね？ 血清由来ですか？それなら無血清培地やchemical defined mediumを使用するとか。 脳スライスや神経系細胞培養ならartificial cerebrospinal fluidやTyrode's solutionが短時間の維持培養には使えると昔聞きましたが、Hank's BSSでも短時間の培養ならいけませんか？

(無題) 削除/引用 No.11811-2 - 2023/09/28 (木) 17:45:56 - 774 その論文ではどのように「培地中にインヒビターが存在する」と示しているんです? HEPESや生食に当該タンパク質を放り込んで活性測定したら活性があると? 生理条件とかけ離れた条件で活性があってもあまり意味ないと思うけど。 (生体内局所的に特異な条件ということはありますが) そもそも一々対抗する必要があるでしょうか。

HEK293細胞をHEPES Buffer salineで培養したい 削除/引用 No.11811-1 - 2023/09/28 (木) 17:01:51 - 駆け出し研究者 初めまして。 皆さんの質問が解決していく様子を見て、 私も初めて質問してみることにいたしました。 HEK293細胞に様々なタンパクを過剰発現させ、酵素活性を評価した論文をアクセプトできました。 そんな中、酵素活性なしと判断したタンパク質について、 培地中にインヒビターが存在するせいで活性が出てないと反対論文が投稿されました。 反対論文に対抗するため、培地ではなくHEPES Buffer SalineやPBSでHEK293細胞を培養して酵素活性を評価することにいたしましたが、どちらもすぐに細胞が剥がれてしまい上手くいきません。 もしHEK293細胞をPBS等で培養した経験がある方がいらっしゃいましたらアドバイスを頂きたいです。 また、もし別の方法で解決できそうな場合、ご教授いただけないでしょうか。 素人であまり分かっておらず申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

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