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(無題) 削除/引用 No.11810-8 - 2023/09/29 (金) 04:55:14 - おお G25さんの説明をみると、薬剤耐性のところに入れているという解釈は間違えですね。そもそもふつうはしませんし。ＬａｃＺを発現するクローニング用プラスミドで、そのマルチクローニングサイトはＬａｃＺの活性に重要な部分に置かれている。そこにインサートがはいるとＬａｃＺはインサートのアミノ酸配列により活性を失うことになるが、インサートの配列は発現することになる。インサートが入ったＬａｃＺの失活はＬａｃＺの活性を発色によって検出することによって判断できるようになっている。 あまり適当な想像をせずに、使われているプラスミドとかマテメソとか調べてみるのが先ではないですか？ https://www.addgene.org/80518/ https://www.fishersci.com/shop/products/promega-pgem-t-pgem-t-easy-vector-systems-4/p-127641

(無題) 削除/引用 No.11810-7 - 2023/09/28 (木) 11:49:37 - G25 最初の論文だけざっと読んだだけだけど、 rescue constructは標的遺伝子のPCR産物をpGEM-Tに組込んだものと書かれているだけなので、組み込んでいるのはプロモータ+オペロンではなく、 単一の遺伝子のCDSをPCRで増やしたものだと読んだ。 pGEM-Tのクローニングサイトはlacプロモータの支配下なので、これのconstitutiveな転写で発現しているのではないか（宿主はlacプロモータを強く抑制するlacI^qではなさそうだし、lacI^q宿主でもかなりleaky expressonするもの）。 プロモータ+オペロンだと大抵のものはサイズが大きすぎてPCRするのもプラスミドベクターに入れるのも容易ではないし、第一、複数の遺伝子産物を含むオペロンでは、どの遺伝子産物に責任があるか特定する目的には合わない。

(無題) 削除/引用 No.11810-6 - 2023/09/28 (木) 10:46:14 - Skeptics 他の遺伝子ORFを除くことで当該遺伝子の発現に影響が出ることが無いとは言えませんが、試してみて相補すればOKという基準で判断することになろうかと思います。 そもそも他の遺伝子が相補している可能性が排除し切れていないことが問題にならないようなケースの方が多いようにも思いますが、それは実験次第でしょう。

(無題) 削除/引用 No.11810-5 - 2023/09/28 (木) 10:32:52 - as Skeptics様 ご回答いただきありがとうございます。 operonの中腹の遺伝子を発現させたい場合は上流の遺伝子を飛ばすような挿入用DNA断片を設計・合成すれば良いということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11810-4 - 2023/09/28 (木) 09:30:53 - Skeptics 説明が舌足らずだったかな。 発現ベクターじゃなくて、大腸菌内で増えるベクターのクローニングサイトに十分な長さ（その判断は多少迷うことがあるかもしれませんが）のゲノム断片をクローニングすれば十分。

(無題) 削除/引用 No.11810-3 - 2023/09/28 (木) 09:28:24 - Skeptics 大腸菌の遺伝子を大腸菌で発現させるのでしたら、プロモーターなど発現に必要なシスエレメントはその遺伝子本来のものを使う、というか、ORFだけでなくシスエレメントを含むようなゲノム断片を使えばOK。

(無題) 削除/引用 No.11810-2 - 2023/09/28 (木) 09:15:44 - as Induction of Human β-Defensin 2 by the Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 Is Mediated through Flagellin Deletion of the cheZ gene results in the loss of swimming ability and the decrease of adhesion ability to Caco-2 cells in Escherichia coli Nissle 1917 Deciphering the interplay between the genotoxic and probiotic activities of Escherichia coli Nissle 1917 投稿者です。 すみません。URLが載せられなかったので、題名で失礼します。

大腸菌用発現ベクター 削除/引用 No.11810-1 - 2023/09/28 (木) 09:14:13 - as BL21 (DE3)のように使える発現ベクターがこれだと決まっているような大腸菌ではない大腸菌を親株として使う場合を想定しています。 （例えば、ヒト糞便由来Nissle1917の場合) このような株で遺伝子KOを作成し、プラスミドで相補実験する論文を見てみると、 クローニングベクターにKO遺伝子を乗せて相補している例が見つかるのですが、 これは薬剤耐性遺伝子の位置をORFと捉えてそこに目的遺伝子を挿入しているということなのでしょうか。 きちんとした発現ベクターではなくクローニングベクターを用いるこういった方法は普通なのでしょうか。

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