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(無題) 削除/引用 No.11809-8 - 2023/09/28 (木) 21:09:21 - KK ご教授いただきましてみなさまありがとうございます。 ・細胞懸濁液をsingle cellになるようにしっかり懸濁する。その際にはピペッティングが推奨される。 ・マルチチャンネルピペットを使う場合はリザーバーでしっかりピペッティングする。シングルピペットの際にも常時撹拌する。 ・ウェルのなかで均一に分布するように培地の温度に注意する。 ・実験への影響を少なくするため実験で使用するプレート内でのウェルの場所に気を使う。 ことなど留意したいと思います。 このたびはご教授いただきましてありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11809-7 - 2023/09/28 (木) 11:22:17 - 774 懸濁より前、はがして回収する時点でシート状や細胞塊ではなくほぼバラバラになっていることを確認します。 遠心して再懸濁時、初めから目的の量に合わせて培地を入れるのではなく、3-5mLの培地で十分にピペッティング(P1000のピペットで10回くらい)→目的量に合わせて、今回の場合であれば10mLピペットで液の底から吸って液の上の方で吐き出す感じで3回くらいピペッティング。 蒔く途中も数列ごとに10mLピペットでピペッティングします。 ボルテックスは細胞によってはダメージを受けるかもしれないし、転倒混和はコンタミのリスクになるので基本的にしません。

(無題) 削除/引用 No.11809-6 - 2023/09/28 (木) 09:51:01 - LPS マルチチャンネルピペットを使って細胞が沈まないうちに素早く。 シングルチャンネルピペットなら、播種の間は元のチューブはずーっと攪拌していますね。

(無題) 削除/引用 No.11809-5 - 2023/09/28 (木) 09:33:09 - Skeptics 「ウエル内で一様になるように」の意味での均一ではなく、「ウエル間で細胞数のバラツキが無いように」の意味ですよね。

(無題) 削除/引用 No.11809-4 - 2023/09/28 (木) 01:11:26 - あの 過去スレにあったと思いますが、 細胞懸濁液をウェルに入れるときは、“の”の字を書く様に入れるとか、細胞を入れた後には振らないとか。 それから、 (1)同一プレート内でも、周囲に位置するウェルと、内側に位置するウェル(96ウェルプレートなら6行10列)では差が生じたり、 (2)プレート間でも、温度等の違いで差が生じるから、 それらの差を意識したデザインにするのが大事ですね。

(無題) 削除/引用 No.11809-3 - 2023/09/27 (水) 21:10:30 - てってってー �@ ボルテックスはやめておいた方がいい気がしますが、転倒混和も蓋に液体が付いてコンタミの原因になったりしそうなので個人的にはあまり好きじゃないです tubeは大抵振って混ぜるくらいにしてますが、沈みやすい細胞とかの場合はディスポのメスピペットで吸って吐いてを何回かすることで撹拌することもあります。 プレートに撒くのであればリザーバー→wellの前にピペッティングはしっかりするようにしてます �A わたしは基本的に37度のホットプレート上で、あらかじめインキュベーターで37℃に温めておいた96プレートに、37℃で懸濁した細胞を撒くようにしてます。もっとこだわる時は懸濁する時の培地自体もCO2インキュベーターで平衡化した上で使い、96プレートに1/4-1/2量の培地を予め入れてインキュベーターで平衡化しておいたところに細胞を播種するようにしてます。 逆に37度のホットプレートがない時は細胞も96プレートも室温で扱い、播種後も細胞が沈むまで室温で静置した後でインキュベーターに入れるようにしてます。 細胞正着前のプレートのwell内の温度ムラは変な対流が生じることによるwell内における細胞の不均一さを生む原因になってると思ってます

(無題) 削除/引用 No.11809-2 - 2023/09/27 (水) 13:04:41 - K まず懸濁液がシングルセルになっていることが大切ではと思います。計算板でカウントする際、９区画全体におけるシングルセルがおよそ９０％以上であることが目安になると思います。時間が経つとふたたびだんだん凝集してくることもありますから、シングルセルにしたらいつまでも置かずに以降の行程ははなるべく速やかにすすめたほうがよいでしょう。

細胞を均一にまく方法 削除/引用 No.11809-1 - 2023/09/27 (水) 11:29:29 - KK いつも勉強させていただいております。 細胞を均一にまく方法でご相談があります。 現在96wellプレートに細胞を2000cell/wellでまいて、5日間連続で増殖アッセイでの評価を行っております。いままでのトピックを参考に、細胞をまく際に懸濁液の量を200μlにすることでウェル内での細胞の散らばりは均一にすることができました。ただ各ウェルや、各プレートによって目視での細胞数にばらつきがあります。 初日に細胞をまく際に細胞懸濁液20ml程度作ってそこからまいているのですが、そのおおもとの細胞懸濁液が均一にまざっていない可能性や、細胞をまく際にこまめに細胞懸濁液を転倒混和はしているものの不十分な可能性を考えております。 そこで質問があります。 �@ おおもとの細胞懸濁液を作る際に培地で希釈することになると思いますが、その際どの程度しっかりまぜていますか？ここも転倒混和にしているのですが、ボルテックスしたりしてもよいものでしょうか？ �A 各ウェルに細胞をまく際に注意していることがあればアドバイスいただければと存じます。 何分実験初心者であり、非常に基本的な相談になり恐縮ではございますが、何卒よろしくお願いいたします。

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