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(無題) 削除/引用 No.11805-10 - 2023/09/26 (火) 21:02:17 - あの ２箇所にピークがあるなら、プライマーダイマーが生じているでしょうね。 アガロース泳動してみることをオススメします。 その際には、プライマーだけのレーンや、サンプルだけのレーンを設けると 何が起きているのかを推測しやすいです。

(無題) 削除/引用 No.11805-9 - 2023/09/26 (火) 20:42:27 - あの NTCで増幅があれば、なんらかのコンタミがあることを疑うべきで、 対策は考えられる全てのことを実施するのが王道だと思います。 正道かどうかはおいておいて、 　右利きの人には、NTCのウェルの位置は、96ウェルプレートの左上をオススメ 　 　NTCのウェルにmixtureを入れたら、すぐに蓋をすることをオススメ いたします。

(無題) 削除/引用 No.11805-8 - 2023/09/26 (火) 20:18:25 - 0324 774R様 プライマーは作り直します。 何度も申し訳ございませんが、下記の点だけ最後に確認させてください。 ターゲット遺伝子とハウスキーピング遺伝子でピークの出現する温度が異なるということは、間違っていませんでしょうか。 ハウスキーピング遺伝子の鋳型有りのピークの温度のところに重なって、ハウスキーピング遺伝子の鋳型無しのピークも出ています。 そもそも鋳型有りのハウスキーピング遺伝子も増幅されていなくて、ダイマーになっていることは考えられますでしょうか。シーケンス解析で増幅チェックをしておりません。

(無題) 削除/引用 No.11805-7 - 2023/09/26 (火) 20:05:25 - 774R >２か所にピークが出ておりますが 2箇所出てるうちの一つがプライマーダイマー由来かと思いましたが、もう一つの真のピークがNTCにも出てるということですか？ そうだとするとさっぱり分かりません。 ΔCT=5 だと32倍なのでコンタミの可能性は棄却されます。 とりあえずプライマーを作り直しては？

(無題) 削除/引用 No.11805-6 - 2023/09/26 (火) 18:34:25 - 0324 774R様 プライマーダイマーの痕跡がない、と記載したものですが、 Melt Peakでターゲットとハウスキーピング遺伝子の温度以外のところにピークが見られなかったため、そのように判断しました。この解釈が違いますでしょうか。 増幅の見られるハウスキーピング遺伝子のNTCは鋳型の代わりに水を入れていますが、鋳型を入れたハウスキーピング遺伝子のピークと同じ温度、ほぼ同じ高さでMelt Peakがみられます。 鋳型が存在しないのにシグナルが出るということは、dsDNAの由来はプライマーしか考えられなくない、とはその通りと思います。プライマーダイマーであった場合、Melt Peakのピークが出る温度が異なると思っていましたがこれが間違っていますでしょうか。 Cq値は鋳型ありのものと比べて、5程度しか変わりませんので、影響があると思っています。 プライマーの再設計を行うべきと理解しましたが、上記の点についてご教授いただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11805-5 - 2023/09/26 (火) 17:28:28 - 774R 状況が良く分からないのですが、NTC（鋳型無し？）で増幅が見られるのは、対策後も引き続きということでしょうか？ その時のCq値は鋳型あり物もと比べてどのくら違うのでしょう？十分に差があるならば、問題にはならないのでは？

(無題) 削除/引用 No.11805-4 - 2023/09/26 (火) 17:21:38 - 774R プライマーダイマーの痕跡がない根拠が私には分かりませんが、鋳型が存在しないのにシグナルが出るということは、dsDNAの由来はプライマーしか考えられなくないですか？ SYBR Green用のプライマーなら通常のPCRで使うオリゴで済むわけで、注文の翌日には届きますし、費用も2000円以下。私なら最初に試します。

(無題) 削除/引用 No.11805-3 - 2023/09/26 (火) 17:10:05 - 0324 774R様 早速のご回答をありがとうございます。 東洋紡のKOD SYBRを使用しております。 Melt Peakの確認でプライマダイマーの痕跡が無くてもdsDNAができている可能性はあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11805-2 - 2023/09/26 (火) 16:59:48 - 774R Melt Peakを見てるということはSYBR Green系ですか。 template無しでシグナルが出てしまっているということはプライマーダイマー等でdsDNAが出来てるということですよね。 プライマー再設計が第一選択だと思います。

qPCR　NTCの増幅 削除/引用 No.11805-1 - 2023/09/26 (火) 16:51:06 - 0324 お世話になります。 このトピックはこの掲示板ではよくトピックに上がっているのも見かけ、参照しましたが解決しないので、助けて頂けますと幸いです。 植物サンプル間の発現量の違いを比較するために、実験しております。 ここまで10回ほどの実験で、ハウスキーピング遺伝子のNTCに毎回増幅が見られます。ターゲット遺伝子のNTCには増幅が見られません。 コンタミ疑いのため、 ・ピペット洗浄 ・滅菌水、試薬、プライマーの新品交換 ・実験者の交替 を行いました。 Cq値は25で5段階希釈したサンプルのCq値20〜27程度と差がありません。 Melt Peakはターゲット遺伝子とハウスキーピング遺伝子で、２か所にピークが出ておりますが、それ以外のところにはピークは出ておりません。 ハウスキーピング遺伝子のプライマー再設計をした方が良いでしょうか。

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